Monovalentin traptavidiinin tuotto ja puhdistus

Abstract

Opinnäytetyö tehtiin Tampereen yliopiston Protein Dynamics -tutkimusryhmässä, joka tutkii proteiinien konformaatioiden ja toiminnan välisiä suhteita. Työn tavoitteena oli tuottaa ja puhdistaa monovalenttia streptavidiinia, joka on hyödyllinen työkalu biotekniikan tutkimuksessa sen poikkeuksellisen biotiinin sitomiskyvyn vuoksi.

Streptavidiini on tetrameerinen proteiini, jonka vuoksi monovalentin muodon aikaansaamiseksi E.colissa tuotettiin kahta mutanttia: kuollutta streptavidiinia, joka ei sido biotiinia, sekä traptavidiinia, joka sitoo biotiinia streptavidiinia tiukemmin. Proteiinit puhdistettiin affiniteettikromatografialla, jonka jälkeen kuollut ja elävä muoto voitiin yhdistää. Traptavidiinia hyödynnettiin, koska eri tetrameerimuodot pystyttiin erottamaan sen C-terminuksesta löytyvän E6-glutamiinihappotagin avulla ioninvaihtokromatografialla. Tagin negatiivisen sähkövarauksen vuoksi eri variantit erottuivat tetrameerien sisältämien tagien lukumäärän mukaan, kun eluointipuskurin suolakonsentraatiota nostettiin ajon aikana. Tällöin saatiin kerättyä talteen myös haluttu monovalentti muoto.

Puhdistuksesta saaduista fraktioista karakterisoitiin traptavidiinin eri tetrameerimuodot SDS-PAGElla. Kun näytteisiin lisättiin biotiinia sisältävää peptidiä, eri muodot liikkuivat geelillä niiden biotiininsitomiskohtien mukaisessa järjestyksessä. SDS denaturoi lisätyn peptidin, muttei itse streptavidiinia, jolloin liikkuminen perustui proteiinien molekyylimassojen sijaan niiden sähkövarauksiin.

SDS-PAGEn tulosten perusteella voitiin todeta, että muodot saatiin hyvin erotettua toisistaan. Lopputuotteista mitattiin myös niiden sisältämien proteiinien partikkelikokoa, homogeenisuutta ja massaa, jotka myös antoivat hyviä merkkejä niiden laadusta. Tulosten perusteella pystyttiin toteamaan, että työlle asetetut tavoitteet täyttyivät. Saadulle lopputuotteelle ja sen mukana laaditulle tuottoprotokollalle on työn toimeksiantajalle jatkokäyttöä; esimerkiksi tuotteen mahdollisesta kaupallistamista tutkimuskäyttöön on harkittu, jota varten tuottoprosessia voisi vielä optimoida tehokkaammaksi.