Directed Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Retinal Pigment Epithelium : Comparison of Adherent and EB-like Culture Methods

Abstract

Retinal pigment epithelium (RPE) is an epithelial cell monolayer located in the retina region at the back of the eye. RPE has a significant function in the eyesight as it plays a key role in the supporting of photoreceptor functions. Disorders of RPE lead to degenerative eye diseases – such as macular degeneration and retinitis pigmentosa – that are the leading causes of blindness. In the future, these blinding retinal disorders could potentially be cured by utilizing regenerative medicine. Degenerated RPE could be replaced by tissue graft derived from human pluripotent stem cells (hPSC).

Currently, the differentiation of hPSCs to RPE cells is inefficient and results in low yields of functional cells. The yield of differentiated cells could be improved for example by chemical induction of the cells. The objective of the thesis was to further optimize a directed RPE differentiation method. In the future, more effective ways to produce hPSC-RPE could be used to develop tissue grafts that can be utilized in regenerative medicine.

The aim of the study was to compare adherent and embryoid body (EB)-like culture methods for directed differentiation of hPSCs into RPE. The comparison was done by evaluating the formation of melanin pigmentation between different culture methods and by analyzing the quality of the produced cells. The hPSCs used in this thesis were human embryonic stem cells (hESC) and induced pluripotent stem cells (iPSC). Differentiation was directed by a use of growth factor and small molecule induction.

Cells produced in this study were analyzed by morphology, transepithelial resistance (TER) and immunocytochemical stainings focusing on RPE markers. The characterization methods provided information about the differentiation status of the cells, including morphology, tightness of the cell junctions, protein expression and polarization of the cell monolayer.

The results suggest that for this protocol of directed differentiation of hPSCs into RPE, the adherent culture method gives significantly better yield than the EB-like culture method. The induction seemed to work with both hESCs and iPSCs, but the yield tended to differ between the stem cell types, favoring the differentiation of hESC-RPE cells. The cell cultures on porous Polyethylene Terephthalate (PET) membrane did not form a confluent cell monolayer, and further research is needed on the reasons behind this behavior. However, the immunostainings suggested that the quality of hESC-RPE was desirable despite the relatively young age of the differentiated cells.

Verkkokalvon pigmenttiepiteeli (RPE) on retinassa sijaitseva yksikerroksinen solukerros, jolla on useita tehtäviä verkkokalvon valoaistinsolujen ylläpidossa. Monet sokeuteen johtavat sairaudet, kuten verkkokalvon ikärappeuma ja pigmenttidegeneraatio, ovat seurausta RPE-solujen vaurioitumisesta. Kantasolujen hyödyntämistä kudosteknologisissa sovelluksissa pidetään lupaavana tulevaisuuden hoitokeinona verkkokalvon vaurioiden hoidossa. Laboratorio-olosuhteissa voidaan tuottaa kaikkikykyisistä kantasoluista kasvatettuja siirteitä, joilla on mahdollista korvata vaurioituneita alueita.

Nykyisin yleisesti käytetyt RPE-solujen erilaistusmenetelmät ovat suhteellisen tehottomia, sillä erilaistuksella tuotettujen solujen saannot ovat pieniä. Opinnäytetyön tavoitteena oli selvittää adherentin ja suspensioviljelymenetelmien eroavaisuuksia erilaistettaessa kaikkikykyisistä kantasoluista RPE-soluja. Erilaistusmenetelmien kehittyessä kantasoluista voidaan tuottaa RPE-soluja, joita on mahdollista hyödyntää kudosteknologisissa sovelluksissa.

Opinnäytetyön tarkoituksena oli vertailla adherenttia ja suspensioviljelymenetelmää ihmisen kaikkikykyisten kantasolujen suunnatussa erilaistuksessa. Työn tutkittavina kaikkikykyisinä eli pluripotentteina kantasoluina käytettiin ihmisen alkion kantasoluja sekä indusoituja pluripotentteja kantasoluja. RPE-tyyppisten solujen erilaistumista seurattiin visuaalisesti solujen tuottaman melaniinipigmentin avulla. Erilaistusmenetelmiä vertailtiin tarkastelemalla tuotettujen RPE-solujen määrää ja laatua. Soluja karakterisoitiin transepiteelisen resistanssin ja immunosytokemiallisten värjäyksien perusteella. Karakterisointimenetelmät määrittivät epiteelin solujen konfluenssia, solujen välisten liitosten tiiviyttä sekä solujen morfologiaa, polarisoitumista ja erilaistumisastetta.

Erilaistusmenetelmistä adherentti soluviljelymenetelmä tuotti huomattavasti parempia tuloksia. Suunnattu erilaistus tuotti pigmentoituneita soluja sekä alkion kantasoluilla että indusoiduilla pluripotenteilla kantasoluilla, mutta vain alkion kantasoluista saatiin tuotettua tarpeeksi soluja jatkotutkimuksiin. Erilaistetut solut eivät muodostaneet kaikilla viljelyalustoilla RPE-soluille tyypillistä yksikerroksista epiteelisolukerrosta, ja syitä tämän käytöksen taustalla tulisikin tutkia tarkemmin. Solut olivat kuitenkin immunovärjäysten perusteella erilaistuksen kestoon nähden melko kypsiä RPE-tyyppisiä soluja.