Expression of miR-32, Ki-67, Btg2, and Pten in Transgenic Mouse Prostate Tissue

Abstract

Prostate cancer is the most common type of cancer found in men. An advanced form of the cancer – castration-resistant prostate cancer – is responsible for over 28 000 deaths in the United States every year with no current curative treatments available. As a result, new biomarkers and treatments are desperately needed. Putative biomarkers include, for example, certain microRNAs – small non-coding RNAs that are involved in the regulation of gene expression – or tumor suppressor genes that are responsive for cell cycle regulation. The objective of the thesis was to investigate the expression of several biomarkers in transgenic mouse prostate tissue. The purpose was to establish protocols for the in situ hybridization of miR-32, and immunohistochemical staining methods for Ki-67, Btg2, and Pten – and to investigate their expression in transgenic mouse prostate tissue.

During this thesis, a successful protocol for the immunohistochemistry of Ki-67, Btg2, and Pten with PAXgene fixation was established. A working protocol for the in situ hybridization of miR-32 was also established, but with inconsistent staining. A low level of miR-32 expression was detected in the dorsolateral lobe of both wild type (WT) and transgenic (TG) prostates. Ki-67 was shown to have a low expression in both WT and TG prostates. Btg2 was expressed mainly in the basal cells of both WT and TG prostates, including the urethra and ductus deferens. Similarily, Pten expression was observed in the basal cells of both WT and TG urethra and, additionally, in the prostate. All biomarkers had close to identical expression in both WT and TG prostates.

In conclusion, the protocol established here for the immunohistochemistry of Ki-67, Btg2, and Pten is sufficient for further use with commercial PAXgene fixation. However, the immunohistochemistry here should be repeated with fresh tissue sections, in order to ensure consistent staining of all sections. Further optimization should be attempted with in situ hybridization before moving into samples with confirmed prostatic lesions. In the future, the protocol established here for Ki-67, Btg2, and Pten can be used in mouse samples with confirmed prostatic lesions in order to help evaluate their role in prostate carcinogenesis, and in the formation of castration resistance.

Eturauhassyöpä on miesten yleisin syöpä. Kastraatioresistentti eturauhassyöpä on eturauhassyövän edistynyt muoto, johon ei ole löydetty parantavaa hoitokeinoa. Kastraatioresistentti eturauhassyöpä on vastuussa yli 28 000 kuolemasta vuosittain USA:ssa. Tästä johtuen uusia biomarkkereita ja hoitokeinoja etsitään jatkuvasti. Mahdollisia biomarkkereita voivat olla esimerkiksi mikroRNA:t, jotka ovat geenien ilmentymistä sääteleviä lyhyitä ei-koodaavia RNA:ita. Biomarkkereihin voivat kuulua myös eri tuumorisuppressorigeenit, jotka ovat osa solusyklin säätelyä. Opinnäytetyön tavoitteena oli tutkia useiden eri biomarkkerien ilmentymistä transgeenisen hiiren eturauhaskudoksessa. Opinnäytetyön tarkoituksena oli pystyttää in situ hybridisaatio -menetelmä miR-32:n määritykseen sekä menetelmä Ki-67:n, Btg2:n ja Pten:n immunohistokemiallista värjäystä varten ja tutkia pystytettyjen menetelmien perusteella näiden biomarkkerien ilmentymistä.

Ki-67:n, Btg2:n ja Pten:n määritystä varten pystytettiin yleispätevä immunohistokemiallinen värjäysmenetelmä PAXgene-fiksauksella. Lisäksi pystytettiin menetelmä miR-32:n määritykseen in situ hybridisaation avulla, mutta saatu värjäystulos oli epätasaista. In situ hybridisaation tulosten perusteella miR-32 ilmentymistä oli havaittavissa villityypin (WT) ja trasgeenisen (TG) hiiren dorsolateraalisessa eturauhaskudoksessa. Ki-67 ilmentyi pienissä määrin WT- ja TG-hiirten dorsaalissa eturauhaskudoksessa. Btg2 ilmentyi lähinnä WT- ja TG-hiirten eturauhasen, virtsaputken ja siemenjohtimen basaalisoluissa. Pten ilmentyi WT- ja TG-hiirten virtsaputken basaalisoluissa ja heikosti eturauhaskudoksessa. WT- ja TG-hiirten ilmentymisessä ei havaittu suurta eroa minkään biomarkkerin yhteydessä.

Opinnäytetyössä pystytetty immunohistokemiallinen värjäysmenetelmä on tarpeeksi luotettava jatkotutkimuksia varten. In situ hybridisaation tulosten parantamiseksi tulisi suorittaa lisää menetelmän optimointia. Lisäksi saadut immunohistokemialliset värjäykset tulisi toistaa tuoreemmilla kudosleikkeillä, jotta saataisiin selvitettyä syy mahdollisiin värjäyseroihin kudosleikkeiden välillä. Tulevaisuudessa opinnäytetyössä pystytettyjä menetelmiä voidaan käyttää hyödyksi eturauhassyöpää sairastavien hiirilinjojen tutkimisessa. Tutkimalla ilmentymistä näissä hiirilinjoissa voidaan arvioida näiden biomarkkerien roolia eturauhassyövän synnyssä sekä kastraatioresistentin eturauhassyövän muodostuksessa.