Fosfolambaanin tuottaminen ja puhdistus

Abstract

Fosfolambaani on pienikokoinen proteiini, joka fosforylaation seurauksesta inhiboi sydänlihaksen supistumisesta vastaavan SERCA2a-proteiinin toimintaa rentouttamalla sydänlihasta. Fosfolambaanin merkitys sydänlihaksen toimintamekanismissa on hyvin olennainen, ja tämän vuoksi proteiinin rakenteen ja toimintamekanismin parempi ymmärtäminen auttaa kehittämään sydänlihaksen toiminnalliseen häiriöön liittyviä hoitomuotoja.

Opinnäytetyön tavoitteena oli tuottaa ja puhdistaa fosfolambaania kahdessa eri muodossa. Tarkoituksena oli saada tuotettua riittävä määrä proteiinia aptameerien valmistamista varten. Opinnäytetyö suoritettiin Tampereen yliopistolla toimivan Protein Dynamics -ryhmän projektina.

Proteiinia tuotettiin His-TEV-PLB-His- ja MBP-PLB-muodoissa. Näistä muodoista jälkimmäinen oli fuusioproteiini, jossa kohdeproteiini on yhdistettynä maltoosia sitovaan proteiiniin. Fuusioproteiini katkaistiin entsymaattisesti fosfolambaanin keräämiseksi. Työn eri vaiheita sekä olosuhteiden vaikutusta proteiinin tuottavuuteen tarkasteltiin ja analysoitiin SDS-PAGElla ja Western blotilla.

Proteiinien tuottamisessa ja puhdistamisessa onnistuttiin tavoitteen mukaisesti. Fuusioproteiinista onnistuttiin katkaisemaan kohdeproteiini ja tulokset saatiin analysoitua. Olosuhteiden vaikutuksesta saatiin alustavia tuloksia ja prosessille pystyttiin muodostamaan toistettavat menetelmät.

This Bachelor’s thesis focuses on the objective of production and purification of phospholamban. The purpose of this thesis was to develop methods for production and purification of phospholamban. This thesis was conducted as a project within the Protein Dynamics group at Tampere University.

For producing the protein in two different forms, His-TEV-PLB-His and MBP-PLB, expression vectors were made. The produced proteins were purified with affinity chromatography and the MBP-PLB protein was enzymatically cleaved with TEV to obtain the target protein PLB-His. The results were analysed using SDS-PAGE and Western blot. The effect of different production conditions and the efficiency of TEV was tested during the process.

The predefined objectives were successfully achieved. The findings suggest that the production of MBP-PLB was more effective, despite the lower yield of cleaved PLB-His compared to the His-TEV-PLB-His form. Preliminary insights into the effects of production conditions were obtained, and reproducible methods for the process were established. The efficiency of TEV and the outcomes of its cleavage were comprehensively examined, providing a foundation for future cleavage initiatives.