Seerumin korvikkeen konsentraation vaikutus RPE-erilaistuksessa

Abstract

Pluripotentit kantasolut pystyvät erilaistumaan kaikiksi aikuisen yksilön solutyypeiksi. Tämän ominaisuuden vuoksi niiden käyttöä pidetään lupaavana hoitokeinona erilaisten sairauksien hoidossa. Silmän verkkokalvon ikärappeuma on yleisin sokeutta aiheuttava tauti. Pluripotenteista kantasoluista erilaistetut verkkokalvon pigmenttiepiteelisolut (RPE-solut) saattavat tulevaisuudessa toimia solusiirteinä taudin hoitokeinona. Erilaistukselle täytyy kuitenkin löytää optimaaliset olosuhteet ilman eläinperäisiä tuotteita.

Erilaistus voidaan tehdä spontaanisti poistamalla kasvutekijät tai ohjaamalla sitä erilaisten kasvutekijöiden avulla. Pluripotenttien kantasolujen kasvatukseen käytetty kasvatusliuos on muuten sama kuin spontaaniin erilaistukseen käytetty kasvatusliuos, mutta siitä on poistettu erilaistumista estävä kasvutekijä.

Tässä tutkimuksessa vertailtiin kasvatusliuoksen sisältämän seerumin korvikkeen konsentraation vaikutusta spontaanissa RPE erilaistuksessa. Seerumin korvike on kallis reagenssi, joten sen määrän mahdollinen vähennys auttaisi laskemaan solujen ylläpitokustannuksia. Tutkimuksessa käytettiin tutkimusryhmän itse pystyttämää alkion kantasolulinjaa ja lahjoituksena Timo Otonkosken ryhmältä saatua indusoitua pluripotenttia kantasolulinjaa. Solujen kehitystä ja erilaistumista seurattiin silmämääräisesti tarkkaillen ja kypsät solut karakterisoitiin. Silmämääräisesti tarkkailtiin melaniinipigmentin ilmestymistä. Eri karakterisointimenetelmillä tahdottiin tutkia ovatko solut erilaistuneet RPE-solujen kaltaisiksi. Pigmentoituneiden solujen määrää kvantitoitiin, solujen morfologiaa arvioitiin ja soluista tutkittiin RPE-spesifejä geenejä: MITF, Bestrophin-1, TYR ja RPE65 ja proteiineja: Bestrophin-1 ja MITF.

Kaikilla tutkituilla seerumin korvikekonsentraatioilla saatiin kasvatettua kypsiä RPE-solujen kaltaisia soluja. Tuloksista ei käynyt yksiselitteisesti ilmi paras konsentraatio. Silmämääräisesti tulokset vaikuttivat kuitenkin heikommilta pienillä pitoisuuksilla. Aihetta on siis hyvä tutkia lisää optimaalisen pitoisuuden selvittämiseksi.

Pluripotent stem cells can differentiate into any adult cell types. This is why their usage as a treatment in different diseases is considered promising. Retinal degenerations are the leading cause of vision loss in the Western world. In the future retinal pigment epithelium cells (RPE cells) derived from pluripotent stem cells can be used as a cure for these diseases in the form of cell transplantations. Optimal conditions for the differentiation without animal origin need to be discovered.

Differentiation can be done spontaneously with growth factor removal or controlled with assistance of different growth factors. The culture medium used in spontaneous differentiation is otherwise the same as the one used with pluripotent stem cells except it lacks the growth factor that prevents the differentiation.

In this study the effects of different concentrations of serum replacement on spontaneous differentiation were compared. Serum replacement is an expensive reagent so the possible reduction of its amount would lower the cell maintenance costs. The cell lines used in this study were the embryonic stem cell line derived by the research group and the induced pluripotent stem cell line which was a donation from another research group led by Timo Otonkoski’s. The development and differentiation was evaluated visually and RPE characters were evalueted from mature cells. Pigmentation appearance were observed visually. Different characterization methods were used to figure out if the cells were differentiated into RPE-like cells. The amount of pigmented cells was quantified, cell morfology was evaluated and the RPE specific genes MITF, Bestrophin-1,TYR and RPE65 and proteins MITF and Bestrophin-1 were analyzed from the cells.

Mature RPE-like cells were succesfully differentiated in all different serum replacement concentrations in the study. The outcome did not indicate exact results for the best concentration. However, the results showed that differentiation seemed to be weaker at low concentrations. It is therefore good to continue the examination of the optimal concentration.