meGFP tuoton optimointi T7 Express -kannassa

Abstract

Tässä opinnäyteyössä optimoidaan monomeerisen parannellun vihreän fluoresoivan proteiinin eli meGFP:n tuotantoprotokolla New England Biolabs T7 Express Escherichia coli bakteerikannassa. Tuotantoprotokollan optimointi on taloudellisesti mielekästä, sillä yhdistelmäproteiinin tuotanto ja puhdistus on kallista ja vie paljon aikaa. Optimoimalla protokolla voidaan säästää resursseja ja kasvattaa tuotantoa.

Tuotantoprotokolla optimoitiin yksimuuttujatesteillä pullokasvatussarjoissa tutkimalla tunnettujen solukasvatukseen vaikuttavien parametrien vaikutusta yhdistelmäproteiinin saantoon. Yksimuuttujatesteissä tutkitaan yhtä parametriä kerrallaan, testien parhaat tulokset vakioitiin seuraavien parametrien testeihin.

Odotusten vastaisesti testien mittaustulokset alkoivat laskea optimoinnin edetessä, optimointia kuitenkin jatkettiin ja testituloksia verrattiin vain testien sisäisiin tuloksiin. On epäselvää mistä tulosten lasku johtui. Opinnäytetyössä pohditaan, että laskun syynä on voinut olla hapenpuute, ennenaikainen ja myöhäinen indusointiajankohta, solujen ja plasmidin kunto, kasvatusliemen koostumus ja yksimuuttujatestin heikkoudet. Täysin varmaa syytä ei kuitenkaan löydetä. Opinnäytetyön lopussa optimoitua tuotantoprotokollaa sovellettiin 10 litran bioreaktorikasvatuksessa. Verrattuna aikaisempaan protokollaan, optimoidun protokollan saanto oli 3,5 kertainen, vain 34 prosenttia kalliimmalla kasvatusliemellä. Optimoitu protokolla otettiin käyttöön Turun ammattikorkeakoulun bioteknologia opintojakson 10 litran tuottokasvatuksiin.

In this thesis the production protocol of the monomeric enhanced Green Fluorescent Protein, i.e. meGFP, is optimized in the New England Biolabs T7 Express Escherichia coli strain. Optimization of the production protocol is economically desirable, as the production and purification of the recombinant protein is expensive and time-consuming. Optimizing the protocol can save resources and increase production.

The production protocol was optimized by single-variable tests in shake-flask culture series by studying the effect of known parameters affecting cell culture growth on the yield of the recombinant protein. As single variable tests examine one parameter at a time, the best test results were standardized for the following parameter tests.

Contrary to expectations, for an unknown reason the test results began to decline as the optimization progressed, nonetheless the optimization was continued, and the test results were only compared to the internal results of a test. It is contemplated that the cause of the decline may have been lack of oxygen, premature and late point of induction, bad condition of cells and plasmid, the composition of the culture broth and the downsides of single-variable tests. However, no definite cause was found. The optimized protocol was applied in a 10-litre bioreactor culture. Compared to the previous protocol, the yield of the optimized protocol was 3.5 times higher, with only a 34 percent more expensive culture broth. The optimized protocol was introduced into the Turku University of Applied Sciences' biotechnology courses' 10-litre protein production culture assignment.