CYP19A1-geenin ilmentyminen hARO-Luc-hiirillä rasvakudoksissa ja mesenkymaalisissa stroomasoluissa : menetelmän optimointi

Abstract

Tämän opinnäytetyön tarkoitus oli optimoida menetelmää, jota käytetään Turun yliopiston Biolääketieteen laitoksella Funktionaalisten elintarvikkeiden kehittämiskeskuksessa lusiferaasiaktiivisuuden määrittämiseen transgeenisten hARO-Luc –hiirten rasvakudoksesta ja mesenkymaalisista stroomasoluista. hARO-Luc-hiirimallissa on siirrettynä lusiferaasireportteri-geeniin yhdistetty ihmisen CYP19A1-geenin säätelyalue. hARO-Luc-hiirimallissa normaalin aromataasientsyymin tuotannon sijasta tuotetaan lusiferaasia. Geenin ilmentyminen voidaan siten määrittää lusiferaasiaktiivisuutta mittaamalla. CYP19A1-geeni säätelee aromataasientsyymin tuotantoa sekä gonadeissa (kiveksissä ja munasarjoissa) että rasvakudoksessa ja muissa perifeerisissä kudoksissa. Aromataasientsyymi toimii osana estrogeenin tuotantoa. Erityisesti postmenopausaalisilla naisilla aromataasin ilmentymisen ja estrogeenin tuotannon nousun rintojen rasvakudoksissa on todettu esiintyvän rintasyövän kanssa samoilla alueilla. Menetelmän optimointiin kuului hARO-Luc –hiiriltä kerättyjen maitorauhasten- ja gonadaalisten alueiden rasvakudoksien sekä reisi- ja sääriluiden luuytimien mesenkymaalisten stroomasolujen altistaminen 250 nM deksametasoni- ja 5 ng/ml TNFα-hoidoille sekä inkubaatioajan testaaminen 24:n, 48:n, 72 tunnin sekä 7 päivän jälkeen hoidoille altistamisesta. Rasvakudoksista ja mesenkymaalisista stroomasoluista analysoitiin lusiferaasiaktiivisuutta kaupallista määritysmenetelmää käyttäen. Optimaaliseksi hoitojen inkubaatioajaksi määritettiin 24 tunnin inkubaatioaika sekä rasvakudoksille että mesenkymaalisille stroomasoluille.

The purpose of this thesis was to optimize the method used in University of Turku, Functional Foods Forum for detecting the luciferase activity in adipose tissue and mesenchymal stromal cells of the transgenic hARO-Luc mice. The hARO-Luc mouse model contains a luciferase reporter gene that is connected to a human CYP19A1 gene regulatory region. Therefore in the hARO-Luc mouse model the normal aromatase enzyme production is substituted with luciferase production instead. Thus the gene expression can be determined by measuring luciferase activity. The CYP19A1 gene regulates aromatase enzyme production both in the testis and the ovaries as well as in the adipose tissue and other peripheral tissues. Aromatase enzyme functions as a part of estrogen production. The increase of aromatase expression and estrogen production in areas of the breast adipose tissue (especially with postmenopausal women) is shown to correlate with the occurrence of breast cancer in the same areas. The optimization of the method consisted of exposition of the collected mammary gland and gonadal fat tissues as well as the mesenchymal stromal cells of the femurs and tibias to the used dexamethasone and TNFα treatments and then testing incubation time with the options of 24, 48 and 72 hours as wells as 7 days after the exposition. Luciferase activity of the treatment exposed adipose tissues and mesenchymal stromal cells was then analyzed using a commercial detection method. The optimal incubation time of the treatments was determined at 24 hours both with the adipose tissues and mesenchymal stromal cells.