Pichia pastoris-hiivakantojen siirtogeenin kopioluvun määrittäminen kvantitatiivisella PCR-menetelmällä
Kiuru, Krista (2014)
Turun ammattikorkeakoulu
2014
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201501041022
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201501041022
Tiivistelmä
Opinnäytetyön tavoitteena oli kehittää kvantitatiiviseen polymeraasiketjureaktioon (qPCR) perustuva menetelmä kopioluvun määrittämiseksi Pichia pastoris –hiivakannoista. Hiivakantoihin oli siirretty Influenssa B-viruksen nukleoproteiinia (IBnP) koodaava geeni transformaatiomenetelmällä, jossa siirtyy useampi geenikopio kerrallaan ja geenikasetissa oli toisena merkkiproteiiina hydrofobiini eri muodoissaan (HFB1_3, HFB1_4 ja Tag 6). Kantavektorina käytettiin pPICZ A -vektoria. Työssä käytettiin sisäisinä kontrolleina ns. single copy –hiivakantoja, joissa oli vain yksi siirtogeenikopio.
Käytettävät alukeparit testattiin käyttämällä E. colista eristettyä, IBnP-geenin sisältävää plasmidia qPCR-templaattina. Varsinaisia qPCR-ajoja varten kasvatetuista hiivasoluista eristettiin genominen DNA (gDNA), jota käytettiin qPCR-templaattina. Hiivakasvatuksista laskettiin myös hiivasolujen määrä FACS-solulaskurilla, jonka jälkeen solut käsiteltiin qPCR:ää varten.
Lopuksi single copy –näytteitä verrattiin multicopy –näytteisiin. Multicopy-näytteet ajettiin rinnakkain single copy – näytteiden kanssa, jolloin saatiin suhteutettu tulos, jota voitiin verrata single copy – näytteistä saatuihin tuloksiin. Tämän perusteella voitiin arvioida voidaanko gDNA eristää siten, että rinnakkaisista näytteistä saadaan suhteellisesti mitattuna oikea tulos, jota voidaan käyttää erilaisen kopioluvun omaavien näytteiden vertaamiseen toisiinsa. Kvantitointitehtiin standardi-suoraa vastaan käyttäen 2nd derivative max –analyysia.
Optimoidulla menetelmällä saavutettiin parhaimmillaan 10 kopion herkkyys hajotetuilla soluilla. Hajottamattomillla soluilla herkkyys oli 100 kopiota. Tämän perusteella voidaan todeta, että PCR-syklaus ei hajota soluja tasaisesti, joten solunäytteet on hyvä esikäsitellä hajottamalla ne. Tämä parantaa huomattavasti menetelmän herkkyyttä.
Käytettävät alukeparit testattiin käyttämällä E. colista eristettyä, IBnP-geenin sisältävää plasmidia qPCR-templaattina. Varsinaisia qPCR-ajoja varten kasvatetuista hiivasoluista eristettiin genominen DNA (gDNA), jota käytettiin qPCR-templaattina. Hiivakasvatuksista laskettiin myös hiivasolujen määrä FACS-solulaskurilla, jonka jälkeen solut käsiteltiin qPCR:ää varten.
Lopuksi single copy –näytteitä verrattiin multicopy –näytteisiin. Multicopy-näytteet ajettiin rinnakkain single copy – näytteiden kanssa, jolloin saatiin suhteutettu tulos, jota voitiin verrata single copy – näytteistä saatuihin tuloksiin. Tämän perusteella voitiin arvioida voidaanko gDNA eristää siten, että rinnakkaisista näytteistä saadaan suhteellisesti mitattuna oikea tulos, jota voidaan käyttää erilaisen kopioluvun omaavien näytteiden vertaamiseen toisiinsa. Kvantitointitehtiin standardi-suoraa vastaan käyttäen 2nd derivative max –analyysia.
Optimoidulla menetelmällä saavutettiin parhaimmillaan 10 kopion herkkyys hajotetuilla soluilla. Hajottamattomillla soluilla herkkyys oli 100 kopiota. Tämän perusteella voidaan todeta, että PCR-syklaus ei hajota soluja tasaisesti, joten solunäytteet on hyvä esikäsitellä hajottamalla ne. Tämä parantaa huomattavasti menetelmän herkkyyttä.