Reaaliaikainen PCR-menetelmä homeiden pitoisuusmääritykseen

Abstract

Kosteusvaurioista johtuvien homeiden terveyshaitat ovat Suomessa jatkuvasti esillä, ja aiheesta uutisoidaan säännöllisesti. Homeista voi vapautua huoneilmaan itiöitä sekä aineenvaihdunnan tuotteita, jotka voivat aiheuttaa ihmisille terveysongelmia. Homeiden tutkimiseen käytetään yleensä mikrobiviljelyä, joka on melko hidas ja epätarkka menetelmä. Hometutkimukseen tarvittaisiin nopeampia ja tehokkaampia menetelmiä, joita voitaisiin automatisoida. Reaaliaikainen PCR-menetelmä on yksi varteenotettava vaihtoehto, sillä se on tarkka ja nopea menetelmä. PCR-menetelmän pystyy myös helposti automatisoimaan.

Opinnäytetyön tarkoituksena oli selvittää homeiden pitoisuuden määrittämisen mahdollisuutta näytteissä PCR-menetelmällä sekä arvioida kaupallisten entsyymien toimivuutta PCR-menetelmässä. Opinnäytetyön tavoitteena on kriittisesti arvioida PCR-menetelmän soveltuvuutta homeiden pitoisuuden määrittämiseen sekä tutkia kaupallisten entsyymien tehokkuutta ja luotettavuutta PCR-analyysissä.

Opinnäytetyön kokeellisen osuuden toteuttamista varten tilattiin kolmea eri kaupallista homekantaa. Homeet viljeltiin maljoille ja kasvatuksen jälkeen niistä eristettiin DNA:ta. Tämän jälkeen DNA-pitoisuus määritettiin spektofotometrillä, ja pitoisuuden avulla voitiin tehdä laimennossarjat PCR-ajoa varten. Laimennossarjoilla saatiin tehtyä standardisuorat, joista pystyy näkemään näytteen DNA pitoisuuden Ct-arvon avulla.

PCR-menetelmä toimi hyvin käytettyjen homekantojen kanssa ja kaikissa kolmessa lajissa saatiin monistumista aikaiseksi. Kahdelle homeelle saatiin standardisuora, joita voisi hyödyntää jatkotutkimuksissa. Homeista voisi esimerkiksi kerätä näytteitä ja mitata niitä PCR-menetelmällä, ja sen jälkeen Ct-arvoa käyttäen katsoa standardisuoralta näytepitoisuuden.

The health risks associated with mold caused by moisture damage are a constant topic in Finland and are regularly covered in the media. Molds can release spores and metabolic products into the indoor air, which may cause health problems for humans. Typically, microbial culturing is used to study molds, but this method is relatively slow and imprecise. There is a need for faster and more efficient methods for mold research that could be automated. Real-time PCR is a promising alternative, as it is a precise and fast method. PCR can also be easily automated.

The purpose of this thesis was to investigate the possibility of determining mold concentrations in samples using the PCR method and to evaluate the performance of commercial enzymes in PCR. The aim of the study is to critically assess the suitability of the PCR method for quantifying mold concentrations and to examine the efficiency and reliability of commercial enzymes in PCR analysis.

Three different commercial mold strains were ordered to carry out the study. The molds were cultured on plates, and after cultivation, DNA was extracted from them. The DNA concentration was then measured using a spectrophotometer, and based on the concentration, dilution series were prepared for the PCR run. These dilution series were used to create standard curves, which allow the determination of the sample's DNA concentration based on the Ct value.

The PCR method worked well with the mold strains used, and amplification was successfully achieved in all three species. Standard curves were obtained for two molds, which could be used for further studies. For example, samples could be collected from molds and measured using the PCR method, and then the sample concentration could be determined from the standard curve using the Ct value.