Kaupallisen RNA-eristyskitin optimointi Bravo-pipetointirobotille

Abstract

RNA, eli ribonukleiinihappo, on biomolekyyli, jota esiintyy kaikissa organismeissa sekä viruksissa. RNA:n yleisimpiä synteesejä ovat transkriptio, eli RNA-synteesi, jossa RNA syntetisoidaan DNA:n ohjeen mukaan sekä translaatio, eli proteiinisynteesi, jossa proteiineja muodostetaan RNA:n ohjeen mukaan. RNA:ta hyödynnetään paljon biolääketieteellisissä tutkimuksissa, koska sen sekvenssi on yksinkertainen ja se tunnetaan jo suhteellisen hyvin. Ei-koodaava RNA toimii eukaryooteilla myös apuna geenien ilmentymisessä sekä auttaa muokkaamaan muuta RNA:ta.

Opinnäytetyön tavoitteena oli optimoida kaupallinen RNA-eristyskitti Bravo-pipetointirobotille. Tarkoituksena oli eristää solulysaatista riittävästi laadukasta RNA:ta pipetointirobotilla sekä analysoida eristettyjen näytteiden konsentraatiota, näytepuhtautta ja laatua NanoDrop 2000- ja 2100 Bioanalyzer-laitteilla. Opinnäytetyö suoritettiin Tampereen yliopiston FHAIVE-tutkimusryhmässä.

RNA:ta eristettiin HUVEC-solujen lysaatista käyttämällä magneettisiin partikkeleihin perustuvaa RNA-eristyskittiä. HUVEC-soluja kasvatettiin kuoppalevyn kuopissa sekä inserttien basaalipuolilla. Automatisoidulla nesteenkäsittelijällä suoritettiin neljä testiajoa näytteillä, joiden perusteella laitteelle tehtyä ohjelmaa muokattiin toimivammaksi eristyskitille. Lopuksi suoritettiin yksi optimoitu ajo pipetointirobotilla. Automatisoidun eristyksen tuloksia verrattiin eristyskitillä käsin tehtyihin eristyksiin.

RNA:n automatisoitua eristystä saatiin optimoitua merkittävästi. Eristettyjen näytteiden konsentraatiota ja puhtautta saatiin parannettua. Myös automaattisen nesteenkäsittelijän pipetinkärkien ja kuoppalevyjen kulutusta saatiin vähennettyä.

RNA or ribonucleic acid is a biomolecule that can be found in every living organism or virus. Its most common and best-known synthesis are transcription, where RNA is formed from DNA’s instructions, and translation, where proteins are made according to RNA’s instructions. In biomedicine, RNA is one of the most exploited molecules, as its sequence is simple and it’s relatively well known. A non-coding RNA in eucaryotic cells also has a role in gene expression and helps edit other RNAs.

The purpose of this Bachelor’s thesis was to optimise a commercial RNA extraction kit for the Bravo pipetting robot. Furthermore, the objective was to extract sufficient amount of high-quality RNA from cell lysate using a pipetting robot and to analyse sample concentrations, purity and quality with NanoDrop 2000 and 2100 Bioanalyzer. This Thesis was completed in the FHAIVE research group at Tampere University.

RNA was extracted from HUVEC cell lysate, using a magnetic bead-based extraction kit. HUVEC cells were cultured on the bottom of 12-well plates and on the basolateral side of inserts. Four test runs were completed with samples using Bravo. Based on these test runs, the protocol was edited to be more functional for the extraction kit used. After the test runs, one optimised sample run was conducted. The results of automated runs were compared to manually extracted samples, which were used as a reference.

The automatic extraction of RNA was optimised significantly. The concentrations and purities of samples were improved. The usage of well plates and pipetting tips were also reduced.