Nanobody-Spycatcher-fuusioproteiinin tuotto ja puhdistus

Abstract

Opinnäytetyö tehtiin yhteistyössä Tampereen yliopiston Protein Dynamics -tutkimusrymän kanssa. Työn tarkoituksena oli tuottaa uudenlaista noroviruksen tunnistavaa fuusioproteiinia. Tuotettava fuusioproteiini on noroviruksen tunnistavan nanobodyn ja Spycatcherin kombinaatio. Proteiini tuotettiin bakteerituottona kaupallisia, kustomoituja plasmideja hyödyntäen.

Opinnäytetyön idea perustuu aiemmin tehtyyn tutkimukseen nanobodyista, jotka sitoutuivat norovirukseen. Kyseisessä tutkimuksessa oli vertailtu useampaa nanobodya ja arvioitu niiden ominaisuuksia muun muassa sen perusteella, kuinka laajasti ne tunnistavat erilaisia noroviruksen kaltaisia partikkeleja. Tutkimuksen perusteella toimeksiantaja päätyi valitsemaan kaksi nanobodya, joiden ympärille rakennettiin fuusioproteiini, joka sisältää Spycatcherin sekä esimerkiksi Histag-kahvan proteiinin puhdistusvaihetta ajatellen.

Bakteerituottoa varten nämä kaksi proteiinikonstruktia tilattiin kustomoituna kau-palliselta toimijalta. Fuusioproteiinin synteesin käynnistävä geeni koodattin pET-vektoriin, Lacoperonin alaisuuteen. Proteiinien tuotossa yleinen yhdistelmä ovat nimenomaan pET-vektori ja E. Coli. Hyvän yhteensopivuuden lisäksi pET-vektoreissa etuna on niiden sisältämä ambisilliiniresistenssin tarjoava geeni, joka toimi näiden kasvatusten selektiivisenä markkerina.

Kummankin proteiinikonstruktin tuottoa yritettiin kahdella solulinjalla, joista toisella saatiin lupaavia tuloksia Nanodrop ja Qubit –mittauksilla sekä erilaisilla geelielektroforeesiajoilla. Näiden mittausten perusteella kumpaakin konstruktia olisi T7 Shuffle –soluissa tuottunut, mutta määrä oli suhteellisen pieni. Työn viimeisenä vaiheena oli tuottuneen proteiinin toteaminen oikeaksi ja toimivaksi. Western blot -menetelmällä saatiin tunnistettua Histag-kahvan omaava proteiini, jonka ominaisuuksia lähdettiin testaamaan.

Tuotetussa fuusioproteiinissa on kaksi pääosaa: nanobody, jonka tehtävä on sitoutua norovirukseen, sekä Spycatcher, joka sitoutuu vastinpariinsa Spytagiin. Osien toimivuutta testattiin liittämällä tuotettua proteiinia Spytagilliseen proteiiniin sekä biosensorikokeella testattiin sitoutumiskykyä norovirukseen. Näiden testien perusteella todettiin konstrukteista vain NB34 toimivaksi ja silläkin tuottunut määrä oli suhteellisen pieni.

This bachelor's thesis was a collaboration with the Protein Dynamics group of the University of Tampere. The purpose of the thesis was to produce a new kind of fusion protein of Spycatcher and norovirus binding nanobody. This nanobody-Spycatcher fusion protein was expressed in E. coli by transformation.

This thesis was based on a previous study on norovirus binding nanobodies isolated from llamas and alpacas. Different nanobodies were compared based on their ability to bind into noroviruses or norovirus like particles. Two most promising nanobodies were chosen to be used in this thesis and their amino acid sequences formed the bases of the fusion proteins. Compared to plain isolated nanobodies, the greatest advantage of the fusion proteins produced in this thesis is that they can be attached into Spytag, which opens multiple new applications in research and diagnostics.

These nanobody-Spycatcher protein constructs were ordered from an external company as customized plasmids. The chosen combination for protein expression was to use E. coli and pET-plasmids, because they are known to be a good match. pET-plasmids have also other useful features, such as the resistance for ampicillin, which can be as a selective marker. In the plasmids used in this thesis, the protein expression gene was coded to work by Lac-operon.

The protein expression was tried with two different cell lines of E. coli, of which the T7 Shuffle looked promising after the Nanodrop and Qubit measurements. The final stage of the thesis was to find out if the protein was working like it should be. Firstly, Spycatcher’s ability to bind into Spytag was tested. For this trial a protein with Spytag was combined with the fusion protein and by comparing the molecular masses it was determined, if they binded. For both constructs, this test was a success. Finally, binding to norovirus was tested. According to the biosensor trial, only NB34 appeared to work properly.

The objective of the thesis was achieved and a working nanobody-Spycatcher fusion protein is possible to express and purify. If this study is continued with NB34, the main objective would be the optimization of the process to maximize volume of the final product.