Ihmisen pluripotenttien kantasolujen jakomenetelmän optimointi

Abstract

Opinnäytetyö tehtiin Tampereen yliopiston Neuroimmunologian tutkimusryhmässä, jonka tutkimuksessa selvitetään neuroinflammatorisia mekanismeja multippeliskleroosissa (MS-taudissa). Tutkimusryhmä hyödyntää potilasperäisiä kantasoluja, joita erilaistetaan keskushermoston eri solutyypeiksi.

Opinnäytetyön tavoitteena oli optimoida kantasolujen jakomenetelmä, jotta kantasoluista saataisiin tasalaatuisia. Opinnäytetyön tarkoituksena oli kasvattaa kahta eri ihmisen indusoitua pluripotenttia kantasolulinjaa (10902.EURCCs ja 04511.WTs) kolmen viikon ajan ja jakaa molempia kasvussa olevia solulinjoja sekä TrypLE (Gibco)- että Versene (Gibco) -irrotusreagensseilla. TrypLE irrottaa soluja entsymaattisesti yksisoluisiksi, kun taas Versene irrottaa niitä ei-entsymaattisesti palasiksi. Kolmen viikon kasvattamisen jälkeen molemmat solulinjat karakterisoitiin tutkimalla niiden pluripotenssimerkkiaineiden ilmentymistä proteiinitasolla ja tutkimalla niiden kyvykkyyttä muodostaa kolmen eri alkiosolukerroksen soluja. Jaetuille soluille tehtiin immunosytokemiallinen (ICC) värjäys ja värjätyt solut kuvattiin Olympus IX51 -fluoresenssimikroskoopilla.

10902.EURCCs solut kasvoivat kasvatusmaljoilla hitaammin verrattuna 04511.WTs soluihin, jonka vuoksi niitä ei saatu kaikkiin analyyseihin mukaan. TrypLE- ja Versene-jaettujen solujen välillä oli havaittavissa selkeä morfologinen ero solulinjan 04511.WTs-soluilla. Kyseisen solulinjan TrypLE-jaetut solut olivat suuria ja pitkänomaisia, eikä solukasvusto ollut yhtä tiivis. Solulinjan Versene jaetut solut olivat pieniä ja morfologialtaan oikeanlaisia. Solulinjan 10902.EURCCs soluilla ei ollut havaittavissa huomattavaa morfologista eroa, vaikka TrypLE-jaetuilla soluilla solukasvusto ei ollut yhtä tiivis kuin Versene-jaetuilla soluilla.

Pluripotenttien kantasolujen ICC-värjäyksistä huomattiin, että molemmat solulinjat ilmentävät pluripotenteille kantasoluille tyypillisiä merkkiaineita, vaikkakin osa vasta-aineista värjäsi solut heikommin. Solulinjan 10902.EURCCs TrypLE-jaettujen solujen vähäisyyden vuoksi ICC-värjäyksen tuloksia on vaikea verrata keskenään. Tämä on havaittavissa myös solulinjan 10902.EURCCs alkiosolukerrosvärjäysten kohdalla. Solulinjan 04511.WTs alkiosolukerrosvärjäyksen kohdalla TrypLE- ja Versene-solut ovat muodostaneet kolmen eri alkiosolukerroksen soluja hyvin samalla tavalla, lukuun ottamatta ektodermi -alkiosolukerrosta, jossa Versene-jaetut solut ovat värjäytyneet tasaisemmin molemmissa solulinjoissa.

This thesis was done in the Neuroimmunology research group of Tampere university. The research group focuses on investigating the neuroinflammatory mechanisms in the autoimmune disease multiple sclerosis (MS). The group utilizes human stem cells, differentiating them into different types of cells found in the central nervous system. The quality and the morphology of the stem cells are crucial in order for the differentiation to be successful.

The purpose of this thesis was to optimize the passaging of stem cells in order to uniform their quality. To achieve this, the objective was to grow two different human stem cell lines for three weeks and passage them using an enzymatic cell dissociation reagent TrypLE (Gibco) and Versene (Gibco), which is a non-enzymatic cell dissociation reagent. After growing the cell lines for three weeks, both of the cell lines were characterized by studying the expression of pluripotent markers on a protein level and by their ability to form the three embryonic germ layers; mesoderm, ectoderm and endoderm. The cells were stained using an immunocytochemical (ICC) staining protocol, after which the stained cells were imagined using an Olympus IX51 fluorescence microscope.

Within the cell line 04511.WTs, there was a clear difference in the phase contrast images between the TrypLE dissociation reagent and the Versene dissociation reagent. The cells that were dissociated with TrypLE had a bigger, more oblong morphology and the gaps between cells were bigger compared to the cells that were passaged with Versene, which were small and round with small gaps between cells. The difference between the dissociation reagents in the cell line 10902.EURCCs was not as notable but within the stem cell line the cells passaged with the TrypLE dissociation reagent had wider gaps between cells.

From the ICC staining of pluripotent stem cells, it could be observed that the cells expressed markers typical to pluripotent stem cells. However, due to the low number of cells in the cell line 10902.EURCCs, it was difficult to compare the results between the dissociation reagents. This could also be seen in the embryonic germ layer ICC staining within the cell line. At the embryonic germ cell layer ICC staining of cell line 04511.WTs, both dissociation types formed the three germ cell layers in a very similar way, except for the ectoderm cell layer where cells passaged with Versene stained more evenly.