Screening and Functionally Analyzing Plasmopara viticola Effectors for Suppressing Grapevine Immunity

Abstract

Plasmopara viticola aiheuttaa viiniköynnöksen lehtihometta, joka aiheuttaa laajoja tuhoja merkittävälle viiiniköynnöslajille Vitis viniferalle globaalilla skaalalla. P. viticola on pakonomaisesti biotrofinen loinen ja se leviää kosteissa olosuhteissa räjähdysmäisesti viinitarhoissa. Biotrofiset loiset saavat ravintonsa elävistä isännistä. Kasviin tunkeutuessaan, P. viticola erittää laajan arsenaalin RxLR-efektoriproteiineja, jotka koostuvat arginiini-muu aminohappo (x)-leusiini-arginiini sarjoista. Efektorit ovat isäntäsoluun toimitettuja molekyylejä, joiden tehtävänä on manipuloida immuunijärjestelmää ja auttaa infektiota leviämään. Työn toimeksiantajan eli Shanghain Jiao Tong yliopisto käytti tutkimuksessaan Center of Viticulture and Enology tutkimuskeskuksen mukaan nimettyä CVE-nimistä DNA-kantaa. CVE-kannan sekvensoinnissa on tunnistettu 182 oletettua RxLR-efektoria tämän DNA:sta, joista osa on aiemmin dokumentoimattomia. Tämän opinnäytetyön tavoitteena on löytää uusia ominaispiirteitä valikoidulle joukolle efektoreja. Taustatiedot on kerätty aihetta käsittelevistä aiemmista tutkimusartikkeleista. Aihetta tarkastellaan seuraavassa järjestyksessä: ensin perusteoriaa kasvien ja taudinaiheuttajien vuorovaikutuksesta, sitten esitellään P. viticolan infektiostrategiat ja sen vaikutukset talouteen ja kestävyyteen, ja lopuksi esitetään RxLR-efektorit ja niiden toimintoja. Keskittymällä näihin kolmeen pääaiheeseen tämä opinnäytetyö pyrkii luomaan vahvan perustietopohjan, jonka avulla lukija pystyisi ymmärtämään aihetta ja sen käsittelytapaa. Tämä opinnäytetyö keskittyi 7 valitun RxLR-efektorin seulontaan ja niiden vaikutusten analysointiin isäntä kasvissa, jotta voidaan määrittää niiden rooli immuunijärjestelmän manipuloinnissa. Efektorigeenit kloonattiin ja ilmenettiin Nicotiana benthamiana-kasvissa Agrobacterium tumefaciens-bakteerin välityksellä. Tuloksia kerättiin onnistuneista klooneista fluoresenssimikroskopialla, solukuolematestillä, reaktiivisten happiyhdisteiden (ROS) havannointitestillä, proteiinin ilmentämistestillä ja Phytophthora capsici -infektiotestillä. Solunsisäisen lokalisoinnin analyysit paljastivat erilaisia efektorien kohdentumismalleja. Efektoreja löydettiin kasvisolun sytoplasmasta sekä tumasta, mikä viittaa toiminnan erikoistumiseen. Solukuoleman testissä ei havaittu välittömiä merkkejä valittujen efektorien aiheuttamasta solukuolemasta. Vain yhdestä efektorista onnistuttiin todentamaan tämän hillitsevä vaikutus ROS tuotantoon. Tämä sama efektori myös löydettiin vain solun tumasta fluorenssimikroskoopialla, joka viittaa sen erikoistumiseen ohjelmoidun solukuoleman (PCD) hillitsijänä. Lähes kaikki seitsemän efektoriproteiinia ilmentyivät kasvissa, mutta P. capsici infektio testi ei tuottanut luotettavia tuloksia. Kaiken kaikkiaan tämä työ auttaa edistämään ymmärrystä P. viticola virulenssistrategioista ja näin edistäen efektoritietoon perustuvien jalostusohjelmien ja kestävien tautienhallintastrategioiden kehitystä viininviljelyssä.

Plasmopara viticola causes downy mildew in grapevine, which inflicts widespread damage to the important grapevine species Vitis vinifera on a global scale. P. viticola is an obligate biotrophic parasite and spreads fiercely in vineyards under humid conditions. Biotrophic parasites obtain their nutrients from living hosts. Upon invading a plant, P. viticola secretes a vast arsenal of RxLR effector proteins, which consist of arginine-any amino acid (x)-leucine-arginine motif. Effectors are molecules secreted into a host cell whose task is to manipulate the host's immune system and facilitate infection spread. The commissioner of this thesis, Shanghai Jiao Tong University, used a DNA strain called CVE, named after the Center of Viticulture and Enology, whose sequencing has identified 182 putative RxLR effectors in its genome, some of which are previously undocumented. This thesis aims to find some new characteristic functionalities for a selected array of effectors. The background information was gathered from previous research articles that were affiliated with the subject at hand. The subject is examined subsequently: first, the basic theory of plant-pathogen interactions, then P. viticola infection strategies and impact on economy and sustainability, and finally, RxLR effectors and their functionality are presented. By focusing on these three main topics, this thesis aims to form a strong basic knowledge base for the reader to understand the subject and the way it is handled. This thesis focused on screening and functionally characterizing a selected set of 7 RxLR effectors to determine their roles in influencing plant defense responses. Effector genes were cloned and expressed in Nicotiana benthamiana via Agrobacterium-mediated transient expression. Results were collected from successful clones using fluorescence microscopy, transient cell death assay, reactive oxygen species (ROS) detection, protein expression assay, and Phytophthora capsici infection assays. Subcellular localization analyses revealed diverse effector targeting patterns, including cytoplasmic and nuclear localization, suggesting functional specialization. Using transient expression in planta, no significant necrosis was caused by the cloned effectors. Only one effector was found to suppress the bacterial flagellin peptide flg22-induced ROS burst, suggesting its specialization as a suppressor of PAMP-triggered immunity (PTI). Utilizing the tobacco Phytophtora capsici pathology system, no reliable results were obtained. Overall, this work promotes understanding of P. viticola's virulence strategies, thereby contributing to the development of effector-based breeding methods and sustainable disease management strategies in viticulture.