Haemonchus-, Teladorsagia- ja Trichostrongylus-loisten DNA:n osoittaminen reaaliaikaisella PCR-menetelmällä

Abstract

Loisperäinen maha-suolitulehdus on maailmanlaajuisesti merkittävin pienmärehtijöiden loistauti, joka heikentää eläinten terveyttä ja hyvinvointia sekä aiheuttaa taloudellisia tappioita. Vaikka tartunnat ovat usein oireettomia, ne voivat silti johtaa tuottavuuden laskuun. Ilmastomuutoksen myötä laidunkauden pidentyminen voi edelleen lisätä loisten selviytymistä erityisesti lauhkeilla alueilla.

Perinteinen loisdiagnostiikka perustuu ulosteesta tehtäviin flotaatiotutkimuksiin, jotka eivät kykene erottamaan Strongylida-lahkon loismunia toisistaan niiden samankaltaisen morfologian vuoksi. Tämän vuoksi on kehitetty spesifisempiä menetelmiä, kuten molekyylibiologisia menetelmiä. Kehittyneiden DNA-eristysmenetelmien ja inhibiittoreiden poistotekniikoiden ansiosta ulostenäytteet soveltuvat nykyään hyvin reaaliaikaiseen PCR-diagnostiikkaan.

Tämän opinnäytetyön tavoitteena oli kehittää Ruokaviraston eläintautidiagnostiikkaa varten reaaliaikainen multiplex-PCR-menetelmä, jolla voidaan osoittaa Haemonchus-, Teladorsagia- ja Trichostrongylus-loisten DNA pienmärehtijöiden ulostenäytteistä. Työn tarkoituksena oli optimoida PCR-olosuhteet siten, että kaikkien kolmen loissuvun DNA:t voidaan luotettavasti analysoida samanaikaisesti yhdessä multiplex-PCR-reaktiossa. Menetelmän toimivuutta ja DNA-eristyksen onnistumista arvioitiin aiemmin Ruokavirastossa tutkittujen ulostenäytteiden avulla vertaamalla PCR-tuloksia flotaatiotutkimusten tuloksiin.

Tulosten perusteella menetelmä täytti validoinnin kriteerit ja osoittautui luotettavaksi menetelmäksi täydentämään Ruokaviraston flotaatiotutkimusta. Menetelmä tuo lisäarvoa erityisesti Haemonchus-tartuntojen tunnistamiseen ja tukee kohdennettujen hoitopäätösten tekemistä. Menetelmän käyttö mahdollistaa loislääkityksen tarpeellisuuden paremman arvioinnin, mikä voi vähentää tarpeetonta lääkkeiden käyttöä ja hidastaa lääkeresistenssin kehittymistä.

Menetelmää voidaan jatkossa kehittää kvantitatiiviseksi, mikäli tarkemmalle DNA-pitoisuuksien määrittämiselle on tarvetta suhteellisten pitoisuuksien sijaan. Tämä parantaisi menetelmän sovellettavuutta erityisesti diagnostisen toteamisrajan läheisyydessä.

Gastrointestinal nematodes are a major cause of welfare, production, and economic losses in small ruminants worldwide. Although parasitic infections are often asymptomatic, they can negatively affect productivity. Moreover, climate change and increasing temperatures enhance parasite survival and prolong their persistence on pasture, particularly in temperate northern regions.

Routine flotation techniques are unable to distinguish between the major nematode genera infecting small ruminants. Therefore, the aim of this thesis was to develop and establish a novel real-time multiplex PCR method for the detection of DNA from the nematode genera Haemonchus, Teladorsagia and Trichostrongylus. Method development focused on establishing PCR conditions that allow reliable simultaneous detection of all three genera in a single multiplex reaction. Method performance and DNA extraction success were evaluated using diagnostic faecal samples by comparison with flotation-based diagnostics.

The developed PCR method met validation criteria and provided reliable diagnostic results, making it suitable for implementation in animal disease diagnostics at the Finnish Food Authority. The method complements flotation analysis in assessing parasite infections, with accurate detection of Haemonchus being particularly important for production farms. With further development, the method could be adapted for quantitative analysis to allow more reliable assessment of relative nematode abundances.

Gastrointestinal nematodes are a major cause of welfare, production, and economic losses in small ruminants worldwide. Although parasitic infections are often asymptomatic, they can negatively affect productivity. Moreover, climate change and increasing temperatures enhance parasite survival and prolong their persistence on pasture, particularly in temperate northern regions.

Routine flotation techniques are unable to distinguish between the major nematode genera infecting small ruminants. Therefore, the aim of this thesis was to develop and establish a novel real-time multiplex PCR method for the detection of DNA from the nematode genera Haemonchus, Teladorsagia and Trichostrongylus. Method development focused on establishing PCR conditions that allow reliable simultaneous detection of all three genera in a single multiplex reaction. Method performance and DNA extraction success were evaluated using diagnostic faecal samples by comparison with flotation-based diagnostics.

The developed PCR method met validation criteria and provided reliable diagnostic results, making it suitable for implementation in animal disease diagnostics at the Finnish Food Authority. The method complements flotation analysis in assessing parasite infections, with accurate detection of Haemonchus being particularly important for production farms. With further development, the method could be adapted for quantitative analysis to allow more reliable assessment of relative nematode abundances.