Hyaluronihapon spektrofotometrisen määritysmenetelmän kehittäminen

Abstract

Hyaluronaani eli hyaluronihappo on elimistön kudoksissa esiintyvä luonnollinen polymeeri, jota käytetään muun muassa kosteuttavana ja voitelevana ainesosana silmän ja piilolinssien hoitonesteissä. Uuden silmätippavalmisteen laadunvarmistukseen tarvittiin mittausmenetelmä ennen tuotteen myynnin aloittamista. Tässä tutkimuksessa kehitettiin menetelmä hyaluronihappopitoisuuden määrittämiseksi silmätippaliuoksessa.

Tutkimuksen lähtökohtana käytetään aikaisemmassa tutkimuksessa fermentointituotteen hyaluronihappopitoisuuden määrittämiseen kehitettyä menetelmää. Menetelmä perustuu hyaluronihapon ja kationisen pinta-aktiivisen setyylitrimetyyliammoniumbromidin (CTAB) väliseen reaktioon, jossa muodostuu samea suspensio. Suspension sameus (turbiditeetti) on suoraan verrannollinen hyaluronihappopitoisuuteen ja sitä voidaan mitata absorbanssin avulla.

Tietyllä hyaluronihappopitoisuusalueella ja aallonpituudella spektrofotometrisessä mittauksessa saadaan lineaarinen absorbanssivaste. Seoksen on annettava reagoida aina sama aika ennen mittaushetkeä, jotta saadaan toistettavia tuloksia. Reaktioaikaa tutkittiin mittaamalla seoksen absorbanssia eri aikapisteissä.

Reagenssien lämpötilalla ei ollut vaikutusta mittaustuloksiin, kun reaktiota tutkittiin kolmessa eri lämpötilassa. Myöskään pH ei muutu reaktiossa. Ennen mittausta seosta sekoittaessa on oltava tarkkana, sillä suuret leikkausvoimat saattavat vahingoittaa syntyneitä ionisia sidoksia hyaluronaanin ja CTAB:n välillä. Tutkimuksessa otettiin myös huomioon menetelmän käytännölliseen suorittamiseen ja mittausepävarmuuteen liittyviä tekijöitä.

Hyaluronan or hyaluronic acid is a natural polymer of the body tissues. It is used among others as a moisturizing and lubricating ingredient in eye care and contact lens care solutions. Analysis method development was required for the quality assurance of a new eye drop product. In this thesis, a method for the determination of the hyaluronan concentration in eye drops was developed.

As the starting point for this study, a previous study for the determination of the hyaluronan concentration of a fermentation product was used. The method is based on a reaction between hyaluronan and cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), which is a cationic surfactant. The reaction forms a turbid suspension the turbidity of which is directly proportional to the concentration of hyaluronan and can be quantified by the absorbance.

Spectrophotometric measurement in a certain concentration range of hyaluronan at a certain wavelength results in a linear absorbance response line. The mixture should be allowed to react always at the same time before the measurement so reliable results can be obtained. The reaction time was ana-lyzed by measuring the absorbance at different time points.

The temperature of the reagents had no effect on the results when the reaction was studied at three different temperatures. Also, the pH did not vary in the reaction. The stirring of the mixture before measurements is one critical point because the high shear forces could break the ionic bonds between hyaluronan and CTAB. The study also took into account the practicality and uncertainty of the method.