Enterovirusten tyypitys RT-qPCR-menetelmällä
Jaakkola, Mikael (2015)
Jaakkola, Mikael
Turun ammattikorkeakoulu
2015
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201505188636
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201505188636
Tiivistelmä
Työn tarkoituksena oli optimoida toimiva ja herkkä RT-qPCR-menetelmä enterovirusten tyypittämiseksi monistamalla enterovirusgenomin VP1-aluetta. Optimoinnissa käytettiin näytteinä plasmidiin kloonattuja virusgenomeja ja virus-RNA:ta, jotka oli eristetty tunnetuista virustyypeistä.
Tutkimuksessa testattiin eri valmistajien kaupallisia qPCR-reaktiosarjoja, joiden herkkyyttä ja toimivuutta testattiin sekä perinteisellä PCR- että qPCR-laitteella. RT-qPCR-menetelmään siirryttäessä testattiin myös eri valmistajien RT-entsyymien herkkyyttä. Reaktiosarjojen herkkyys määritettiin Cp-arvojen perusteella ja tarkistamalla tuotteet agaroosigeelielektroforeesilla (AGE). Kehitettyä optimaalista RT-qPCR-menetelmää verrattiin erittäin herkkään diagnostiseen ENRI-menetelmään. Optimoidun menetelmän toimivuus testattiin tuntemattomia enterovirus-RNA-näytteitä käyttäen.
Tutkimuksessa havaittiin merkittäviä eroja eri valmistajien qPCR-reaktiosarjojen välillä ja löydettiin selkeästi parhaiten toimiva reaktiosarja, joka tuotti 100 kopion herkkyyden, kun näytteenä käytettiin virus-plasmidia.. Tuntemattomista näytteistä tällä menetelmällä monistettiin VP1-alue 9/19 (47 %) tuntemattomasta enterovirusnäytteestä.
Tutkimuksessa testattiin eri valmistajien kaupallisia qPCR-reaktiosarjoja, joiden herkkyyttä ja toimivuutta testattiin sekä perinteisellä PCR- että qPCR-laitteella. RT-qPCR-menetelmään siirryttäessä testattiin myös eri valmistajien RT-entsyymien herkkyyttä. Reaktiosarjojen herkkyys määritettiin Cp-arvojen perusteella ja tarkistamalla tuotteet agaroosigeelielektroforeesilla (AGE). Kehitettyä optimaalista RT-qPCR-menetelmää verrattiin erittäin herkkään diagnostiseen ENRI-menetelmään. Optimoidun menetelmän toimivuus testattiin tuntemattomia enterovirus-RNA-näytteitä käyttäen.
Tutkimuksessa havaittiin merkittäviä eroja eri valmistajien qPCR-reaktiosarjojen välillä ja löydettiin selkeästi parhaiten toimiva reaktiosarja, joka tuotti 100 kopion herkkyyden, kun näytteenä käytettiin virus-plasmidia.. Tuntemattomista näytteistä tällä menetelmällä monistettiin VP1-alue 9/19 (47 %) tuntemattomasta enterovirusnäytteestä.