Enterovirusten tyypitys RT-qPCR-menetelmällä

Abstract

Työn tarkoituksena oli optimoida toimiva ja herkkä RT-qPCR-menetelmä enterovirusten tyypittämiseksi monistamalla enterovirusgenomin VP1-aluetta. Optimoinnissa käytettiin näytteinä plasmidiin kloonattuja virusgenomeja ja virus-RNA:ta, jotka oli eristetty tunnetuista virustyypeistä. Tutkimuksessa testattiin eri valmistajien kaupallisia qPCR-reaktiosarjoja, joiden herkkyyttä ja toimivuutta testattiin sekä perinteisellä PCR- että qPCR-laitteella. RT-qPCR-menetelmään siirryttäessä testattiin myös eri valmistajien RT-entsyymien herkkyyttä. Reaktiosarjojen herkkyys määritettiin Cp-arvojen perusteella ja tarkistamalla tuotteet agaroosigeelielektroforeesilla (AGE). Kehitettyä optimaalista RT-qPCR-menetelmää verrattiin erittäin herkkään diagnostiseen ENRI-menetelmään. Optimoidun menetelmän toimivuus testattiin tuntemattomia enterovirus-RNA-näytteitä käyttäen. Tutkimuksessa havaittiin merkittäviä eroja eri valmistajien qPCR-reaktiosarjojen välillä ja löydettiin selkeästi parhaiten toimiva reaktiosarja, joka tuotti 100 kopion herkkyyden, kun näytteenä käytettiin virus-plasmidia.. Tuntemattomista näytteistä tällä menetelmällä monistettiin VP1-alue 9/19 (47 %) tuntemattomasta enterovirusnäytteestä.

The purpose of this study was to optimize the functional and sensitive RT-qPCR method for enterovirus typing by multiplying the VP1 region of the enterovirus genome. In the optimization, viral genomes cloned into plasmid and viral RNA isolated from known viral types were used as samples. In this research commercial qPCR kits by various manufacturers were tested for sensitivity and functionality with both conventional PCR and qPCR instruments. In the case of the RT-qPCR method, the sensitivity of RT enzymes from different manufacturers was also tested. The qPCR kit sensitivity was determined on the basis of the Cp values as well as by checking the products by agarose gel electrophoresis (AGE). The developed optimal RT-qPCR method was compared with the highly sensitive diagnostic ENRI method. The functionality of the optimized method was tested with unknown enterovirus RNA samples. The study found significant differences between different manufacturers’ qPCR kits and determined the most effective kit which exhibited a sensitivity of 100 copies when the viral plasmid was used as sample. With this method the VP1 region 9/19 (47 %) of unknown enterovirus samples was amplified.