Ihmisen rinovirusten VP4/2-geenialueen monistaminen RT-qPCR-menetelmällä

Abstract

Rinovirukset ovat yleisiä RNA-viruksia, joiden on todettu aiheuttavan ihmiselle mm. lieviä hengi-tystieinfektioita, keuhkokuumetta, korvatulehduksia ja astmaa. Viruksia tunnetaan yli 100 tyyp-piä. Viruksen genomin 5’ UTR-geenialuetta on käytetty yleisesti rinovirusten tunnistamiseen PCR-menetelmällä, mutta se ei sovellu tyypitykseen. Tässä opinnäytetyössä selvitettiin, onnis-tuuko 650 emäksen pituisen VP4/2-alueen monistaminen RT-qPCR-menetelmällä ja pyrittiin ke-hittämään optimoitu menetelmä geenituotteen muodostamiseksi. Työssä vertailtiin mm. kaupal-lisia qPCR-reaktiosarjoja ja RT-entsyymejä. qPCR-reaktiosarjojen välillä oli selkeitä eroja; KAPA SYBR FAST (Kapa Biosystems) ja SensiFAST SYBR No-ROX (Bioline) –qPCR-reaktiosarjat olivat selkeästi herkempiä kuin edullinen MAXIMA SYBR Green (Fermentas) –reaktiosarja. Tu-lokset osoittivat, että VP4/2-aluetta pystyttiin monistamaan 100 rinovirusgenomia sisältävästä näytteestä. Menetelmä toimi tehokkaasti viljeltyjen rinovirus-RNA-näytteiden VP4/2-alueen mo-nistamiseen. Menetelmän toimivuus pitää testata jatkossa myös kliinisillä näytteillä menetelmän validoimiseksi kliinis-virologiseen käyttöön.

Rhinoviruses are common RNA viruses which cause mild respiratory infections, pneumonia, otitis media and asthma. The 5’ UTR viral gene region of rhinoviruses has commonly been used to recognize rhinoviruses by PCR. However, the 5’UTR region is not suitable for the serotyping of individual viruses. Therefore, the VP4/2 gene area is commonly used for typing different rhinovirus species. In this Bachelor’s thesis it was studied if it is possible to amplify a 650 base-pair-long VP4/2 gene region by RT-qPCR and also to find optimized conditions. The re-sults showed that the VP4/2 gene region could be amplified successfully with reasonable sen-sitivity. It was possible to obtain PCR-product from a sample containing only 100 copies of viral genome. The optimization of the RT-qPCR method included the comparison of the com-mercial qPCR kits and RT enzymes. There were clear differences between the qPCR kits - the KAPA SYBR FAST qPCR Kit (Kapa Biosystems) and the SensiFAST SYBR No-ROX Kit (Bio-line) showed significantly higher sensitivity than the inexpensive MAXIMA SYBR Green qPCR Kit when amplifying the VP4/2 gene region. All the samples used in this study were cultured rhinovirus samples. Therefore, the functionality of the RT-qPCR method should be tested with clinical virus samples in order to validate the method.