Influenssa B -viruksen nukleoproteiinin puhdistus

Abstract

Työn tavoitteena oli puhdistaa Influenssa B -viruksen nukleoproteiinia (InB-NP), joka on Pichia pastoris -hiivakannassa tuotettu rekombinanttiproteiini, johon on liitetty hydrofobiini-fuusioproteiini. Puhdistettavan fuusioproteiinin teoreettinen koko on 82,5 kDa, mutta aiempien tulosten perusteella proteiini aggregoituu partikkelimaiseen muotoon.

Työssä käytettiin ioninvaihtokromatografiaa (IEX), geelisuodatusta (GF) ja ultrasentrifugointia sekä erikseen että peräkkäin. Ennen varsinaisia puhdistusmenetelmiä näytteelle tehtiin esikäsittelyinä muun muassa bentsonaasi-käsittely ja ultrasuodatus. Varsinaisessa työssä verrattiin kahta erilaista lähtönäytettä, jotka erosivat toisistaan siten, että toinen näytteistä oli ultrasuodatettu Pellicon 300 kDa -suodatinkasetilla ja toinen näytteistä oli suodattamaton. Puhdistetun lnB-NP:n analysointimenetelminä käytettiin TR-FIA-, SDS-PAGE- ja Western blot -menetelmiä. TR-FIA-tulosten perusteella ajoille tehtiin puhdistustaulukot.

Kromatografisia menetelmiä käyttäen kohdeproteiini puhdistui parhaiten, kun käytettiin ioninvaihtokromatografiaa ja geelisuodatusta peräkkäin. Tällöin saanto oli 8 %. Ultrasentrifugointi sisälsi kaksi peräkkäistä vuorokauden mittaista ajoa eri matriiseilla. Paras mittaustulos saavutettiin ensimmäisen vuorokauden mittaisen ajon jälkeen 30 %:lla sakkaroosimatriisilla, jolloin näytteen saanto oli 198 %. Kun vastaavan näytteen puhdistusta jatkettiin CsCl-gradientilla, saanto oli 15 %.

Tiivistettynä ultrasentrifugointi vaikutti parhaalta menetelmältä InB-NP:n puhdistamiseksi. Jatkotoimenpiteinä pitäisi mitata proteiinikonsentraatio, jotta spesifinen aktiivisuus olisi mitattavissa.

The objective was to purify influenza B virus nucleoprotein (InB-NP). InB-NP is a recombinant protein produced by a Pichia pastoris yeast and connected to a hydrophobin fusion protein. The theoretical size of the fusion protein is 82.5 kDa but on the basis of past previous results, the protein aggregates into particulate form.

As methods Ion-exchange chromatography (IEX), gel filtration (GF) and ultracentrifugation were used, both individually and in succession. Before the actual purification methods, the samples were subjected to pretreatments such as benzonase treatment and ultrafiltration. Two kinds of output samples were compared, which differed from each other in that one of the samples was ultrafiltered with a Pellicon 300 kDa cassette and the other one was unfiltered. As analysis methods for the purified influenza B virus nucleoprotein TR-FIA, SDS-PAGE and Western blot were used. On the basis of the TR-FIA results, purification tables were compiled for the runs.

When using chromatographic methods for purifying the target protein, the best option was to use ion exchange chromatography and gel filtration successively, producing a yield of 8 %. Ultracentrifugation comprised two consecutive-day runs of different matrices. The best result was obtained after the first day with a 30 % sucrose matrix. Here, the yield was 198 %. When the sample purification was continued with a CsCl gradient, the yield was 15 %. When using chromatographic methods, the best protein purification was achieved with successive ion-exchange chromatography and gel filtration.

In conclusion, ultracentrifugation seemed the best method for InB-NP purification. The next step should be to measure the protein concentration to enable measurable specific activity.