Kvantitatiivisen PCR-menetelmän validointi mecC MRSA -kannalle

Abstract

Bakteerien nopea evoluutio tuo haasteita lääketieteelle, josta hyvänä esimerkkinä on metisilliinille resistentti Staphylococcus aureus (MRSA). Sen erotusdiagnostiikka on tärkeää potilaan hoidon kannalta, vaikka MRSA:n aiheuttamat infektiot ovat suurilta osin samanlaiset vaikeustasoltaan ja taudinkuvaltaan kuin herkän S. aureuksen aiheuttamat infektiot. Mikrobilääkeresistenttiyden takia MRSA:ta varten tulee olla sensitiivinen ja spesifinen analyysimenetelmä, jotta sen aiheuttamat infektiot saadaan hoidettua nopeasti ja tehokkaasti oikean hoitovasteen antavalla mikrobilääkkeellä. MRSA:n variantti mecC-kanta (mecC MRSA) tuo potentiaalisen aukkokohdan tähän MRSA diagnostiikkaan, joka tulee sulkea pois menetelmien validoinnilla. Tällöin varmistutaan, että myös mecC MRSA tunnistetaan oikein MRSA:ksi.

Opinnäytetyön toimeksiantajana oli Fimlab Laboratoriot Oy:n mikrobiologian ja molekyylibiologian yksikkö. Työn tarkoituksena oli testata mecC-PCR -menetelmän spesifisyyttä ja sensitiivisyyttä. Tavoitteenamme oli tuottaa tuloksia osana mecC-PCR -menetelmän validointia. Opinnäytetyön teoriaosuudessa käsittelimme S. aureusta, mecA ja mecC MRSA:ta sekä reaaliaikaista polymeraasiketjureaktioita.

Kokeellisessa osuudessa analysoimme 17 eri bakteerikantaa kolmella eri PCR-ohjelmalla. Optimoimme PCR-ohjelmaa muokkaamalla kiinnittymis- ja pidennysaikoja sekä syklien lukumäärää. Parhaan tuloksen antoi PCR-ohjelma 2, jonka spesifisyys oli 84,6 %, positiivinen ennustearvo 50 % ja negatiivinen ennustearvo 100 %. Menetelmän sensitiivisyyttä määritettyämme laimennussarjan avulla voimme todeta, että analyysimenetelmä antaa positiivisen tuloksen reaktioseoksen sisältäessä bakteeria 375 pmy (pesäkkeen muodostava yksikkö). Reaktioseoksen sisältäessä 75 pmy:tä mecC MRSA:ta, tulos oli negatiivinen.

The purpose of this study was to test the specificity and sensitivity of mecC PCR method. The study was conducted in co-operation with Fimlab Laboratories Ldt, Department of Clinical Microbiology and Molecular Biology. The objective of this study was provide results that Fimlab Laboratories Ldt can utilise as part of validation of mecC PCR method.

The data were collected using the 17 different bacterial strains which were further analysed using three different PCR programmes. We optimised PCR programme by adjusting the annealing and extension times, as well as the number of cycles.

The results reveal that the PCR programme 2 was the most specific. Its specificity was 84,6 %, the positive predictive value was 50 % and the negative predictive value was 100 %. The sensitivity analysis revealed that when the reaction mix include 375 cfu (colony forming unit) bacteria, the analysis method gave a positive result by means of the PCR programme 2. When the reaction mix include 75 cfu mecC MRSA the result was negative.