Protokollan pystyttäminen rotan plasmasta eristettyjen solunulkoisten vesikkeleiden karakterisointia varten

Abstract

Opinnäytetyön käytännön osuus suoritettiin A.I. Virtanen instituutille (AIVI) Kuopiossa. Työn tarkoitus on luoda protokolla solunulkoisten vesikkeleiden karakterisoimiseksi rotan plasmasta traumaperäisen epilepsian tutkimusryhmän julkaisuja, ja tutkimustyön näytematriisin varmistusta varten.

Solunulkoisten vesikkeleiden, eksosomien, karakterisoinnissa noudatetaan ISEV:n (International Society of Extracellular Vesicles) minimivaatimuksia. Karakterisoinnissa määritetään proteiiniprofiili ja proteiinikonsentraatio sekä todetaan solunulkoisille vesikkeleille spesifisiä proteiineja.

Solunulkoisten vesikkeleiden karaterisointi on edellytys tieteellisen tutkimuksen osalta, jotta voidaan edetä biomarkkereiden ja jopa hoitokeinojen etsimiseen traumaperäiseen epilepsiaan. On tärkeää voida todistaa työskentelevänsä tarkoituksenmukaisella näytematriisilla. Opinnäytetyössä luotiin AIVIlle toimiva, mutta vielä optimointia vaativa protokolla solunulkoisien vesikkeleiden karakterisointia varten. ISEV:n minimivaatimusten lisäksi pyrittiin saamaan mahdollisimman pienellä näytemäärällä suoritettava karakterisointiprotokolla. Valmiin protokollan avulla voidaan suorittaa tieteelliseen tutkimukseen ja julkaisuun kelpaava karakterisointi. Kun lopullinen optimointi on saatu tehtyä, voi tutkimusta jatkaa ja vertailla proteiiniprofiileja naiivi-, TBI- ja SHAM-eläinten välillä. Näin voitaisi epilepsiaryhmän hypoteesin mukaan nähdä eksosomiprofiilissa selkeä ero SHAM- ja TBI-eläimien eksosomiprofiilissa, verrattuna naiiviin ja toisiinsa. Näin ollen voidaan jatkossa kartoittaa proteiiniprofiilin muutoksista ja konsentraatiomuutoksista mahdollisia biomarkkereita traumaperäisen epilepsian syntymiselle.

The practical work of this thesis was done at A.I. Virtanen Institute of Molecular Sciences in Kuopio, Finland.

The main objective of this thesis was to construct and test a working protocol to characterize extracellular vesicles (EV’s) from rat plasma. In characterizing extracellular vesicles, or exosomes, minimum requirements of ISEV would be met. The characterization would include characterizing their size, protein concentration and composition, and proving the presence of extracellular vesicle specific proteins.

Characterizing extracellular vesicles is a precondition for scientific research. After this the research can be continued to searching for biomarkers and even therapeutical agents for trauma-based epilepsy. It is critical to have a solid characterization protocol to prove you are working with the appropriate sample matrix.

This thesis created a working protocol for characterizing extracellular vesicles. The protocol remains in need of optimizing. While creating the protocol to meet ISEV minimum criteria, a main goal was to reduce the sample size to a minimum while still being able to carry out the whole protocol with one sample. With this protocol, a characterization usable in scientific publications, can be made. When the final optimizing has been done, the research can be continued, and the comparison between naïve, TBI- and SHAM- operated animals can be started. According to the epilepsy research group’s hypothesis, there should be a visible difference in in the exosome profile between the TBI- and SHAM-operated animals and between the TBI- and SHAM-operated animals and the naïve sample. Thus, in the future protein profile and concentration changes may lead to finding biomarkers for trauma-based epilepsy.