DNA-viivakoodaus elintarvikkeiden aitoustutkimuksissa

Abstract

Opinnäytetyön tarkoituksena oli ottaa käyttöön ja validoida DNA-viivakoodaus-menetelmä Elintarviketurvallisuusvirasto Eviralle. DNA-viivakoodaus oli alun perin ekologisiin tutkimuksiin kehitelty menetelmä, mutta pian siitä huomattiin olevan hyötyä myös muilla tutkimusalueilla, kuten elintarvikkeiden aitoustutkimuksissa. Elintarvikepetoksia ja etenkin mereneläviin kohdistuvia väärennöksiä paljastuu yhä enemmän maailmalla. Suomessa näitä väärennöksiä ei ole kovinkaan paljoa tutkittu aikaisemmin.

DNA-viivakoodaus-menetelmä perustuu siihen, että genomista on valittu alue, jossa lajin sisällä emäsjärjestys vaihtelee mahdollisimman vähän ja eri lajien välillä suuresti. Lajit voidaan erottaa toisistaan viivakoodialueen sekvenssien perusteella. Eläinlajeilla käytetään usein mitokondriaalisen DNA:n sytokromi c oksidaasi 1 -geeniä (CO1) ja kasveilla kloroplastin maturaasi K (matK)- ja ribuloosi bisfosfaatti karboksylaasi iso alayksikkö (rbcL) -geenejä.

Opinnäytetyön laboratorio-osuus suoritettiin pääosin Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirasto FDA:n laatiman työohjeen mukaisesti. Kalanäytteestä eristettiin DNA, josta monistettiin PCR:llä tietty nukleotidijakso. PCR-tuote puhdistettiin ja sekvensoitiin. Sekvensoinnin tulokset käsiteltiin bioinformatiikan työkaluin ja saatuja sekvenssejä verrattiin sekvenssitietokantoihin, jolloin saatiin selville näytteen kalalaji.

Menetelmän käyttöönotto onnistui hyvin. DNA-eristys onnistui, mikäli näytemäärä ei ollut liian suuri. Erilaiset matriisit, kuten savustettu tai suolattu kala, eivät aiheuttaneet ongelmia. Poikkeuksena olivat ainoastaan liian prosessoidut tuotteet, kuten öljyyn säilötty purkkikala. Työssä käytetyt alukkeet toimivat usealle lajille, ja lajintunnistus onnistui vähintään sukutasolle asti. Alustavien tutkimusten perusteella samat alukkeet ja menetelmä soveltuvat myös eläinlajien määritykseen.

The purpose of this Bachelor’s thesis was to implement and validate a DNA barcoding method for Finnish Food Safety Authority Evira. DNA barcoding method was originally developed for ecological studies, but soon it was found to be useful in other areas of research as well, such as food authenticity studies. Increasing amount of food frauds, especially seafood forgeries have been found around the world. In Finland, these forgeries have not been studied intensively until recently.

DNA barcoding method is based on analysis of a selected area in the genome. The selected genome area should have as little sequence variety as possible within a species and as much as possible between different species. Species can be identified by the sequences of the barcode region. The cytochrome c oxidase subunit 1 gene (CO1) from mitochondrial DNA is often used with animal identification, and maturase K (matK) and ribulose bisphosphate carboxylase large chain (rbcL) genes from the chloroplast are used when researching plants.

The laboratory work in this thesis was carried out mainly in accordance with the standard operating procedure made by the U.S. Food and Drug Administration FDA. The DNA was extracted from the fish sample, and a specific nucleotide sequence was amplified from the DNA. The PCR product was purified and sequenced. The results of the sequencing were processed with bioinformatics tools, and the gained sequences were compared to sequence databases to identify the species of the fish sample.

The implementation of this method was successful. DNA extraction succeeded if the sample was not too large. Different matrices, such as smoked or salted fish, did not cause problems. The only exceptions were too far processed products, such as fish canned in oil. The primers used in this thesis were functional in many species and the identification of the species was successful until the family level at least. On the bases of the preliminary studies, the same primers and method are also suitable for the identification of several animal species.