Metaboliaentsyymien geeniekspressiotason määritys rotan mahalaukun totaali-RNA:sta RT-qPCR-menetelmällä

Abstract

Opinnäytetyön aiheena oli kahden metaboliaentsyymin geeniekspressiotason määrittäminen RT-qPCR-menetelmällä rotan mahalaukun kudoksista. Työ oli osa aryylihiilivetyreseptorin (AHR) ja AHR-agonistien tutkimusta Helsingin yliopiston Eläinlääketieteellisessä tiede-kunnassa, Elintarvikehygienian- ja ympäristöterveyden osastolla.

Dioksiinien vaikutusten tiedetään välittyvän AHR:n kautta ja niistä TCDD:n (2,3,7,8-tetraklooridibentso-p-dioksiini) on huomattu aiheuttavan alhaisilla pitoisuuksilla rotilla aversiota eli vastenmielisyyttä uusia ruoka-aineita kohtaan. Ilmiön yhteydessä on havaittu sytokromi P450:n metaboliaentsyymien (erityisesti cyp1a1) geeniekspressiotasojen muutoksia rotan maksan kudoksissa. Viimeisimmissä jatkotutkimuksissa AHR-agonistin (C2) toksista vaikutusta on tutkittu yhdessä CAR-agonistin (TPD) ja AHR-antagonistin (CH-223191) kanssa rotan mahalaukun kudoksista. Opinnäytetyö perustui viimeisimpiin tutkimuksiin.

Työn tavoitteena oli selvittää, löytyykö rottien aversion ja mahalaukun kudosten geeniekspression väliltä yhteyttä. Mahalaukun kudoksista eristettiin totaali-RNA, joka puhdistettiin DNAasilla ja käännettiin cDNA:ksi. Cyp1a1 ja cyp2b1 metaboliaentsyymigeenien ekspressiota mitattiin spesifeillä alukkeilla käyttäen RT-qPCR-tekniikkaa, jossa käytettiin fluoresoivaa EvaGreen-väriainetta. Opinnäytetyössä arvioitiin metaboliaentsyymien geeniekspressiotasojen määrittämisen onnistumista erityisesti tekniseltä kannalta.

Tulosten mukaan uusi AHR-agonisti (C2) aiheutti rotissa entsyymi-induktiota, mikä saattaa olla yhteydessä aversioon suklaalle. Samankaltaista aversiota ovat aiheuttaneet myös aiemmin tutkitut AHR-agonistit. Puolestaan CAR-agonistilla (TPD) ei vastaavaa vaikutusta ilmennyt ollenkaan. Aversio näyttää liittyvän suoranaisesti AHR:n toimintaan. Cyp1a1 metaboliaentsyymigeenin ekspressiotasot määritettiin melko luotettavasti (R2=0,9996). Cyp2b1 metaboliaentsyymigeenin ekspressiotasot olivat luotettavuudeltaan välttäviä (R2=0,9879), koska kalibrointisuoran sensitiivisyys ei riittänyt kaikkien näytteiden pitoisuusalueelle. Sulamiskäyräanalyysien perusteella havaittiin myös mahdollisesti vikaa Rotor-Gene-laitteen kalibroinnissa.

Tutkimuksia voidaan jatkaa huoltamalla tai kalibroimalla Rotor-Gene-laite, jolloin mahdollisesti laitteesta johtuva vika saataisiin paikannettua vertaamalla sulamiskäyräanalyysejä. Päätelmiä AHR:n molekulaarisesta mekanismista voidaan tehdä analysoimalla tuloksia tilastollisesti esimerkiksi SPSS-ohjelmalla.

The Bachelor’s thesis project was a part of Aryl hydrocarbon receptor (AHR) and AHR-agonists studies in the Department of Food Hygiene and Environmental Health, in the Faculty of Veterinary Medicine, at the University of Helsinki. The thesis focused on two metabolic enzymes whose gene expression was determined from isolated total RNA of rat stomach tissue with RT-qPCR.

In the cell the metabolic response of dioxins is mediated by the AHR. The most potent AHR-agonist 2, 3, 7, 8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) has an inducing effect on gene expression of cytochrome P450’s metabolic enzymes (Cyp1a1) in rat liver. Exposure to below-toxic doses of TCDD caused strong aversion towards novel food items in rats, which correlated with increasing levels of cyp1a gene expression in the liver. In the recent studies, the toxic effect of an AHR-agonist (C2) has been examined with a CAR-agonist (TPD) and an AHR-antagonist (CH-223191) in rat stomach. The thesis is based on the latest experiments.

The goal of the study was to examine a relation between the aversion and the gene expression of metabolic enzymes in rat stomach. The total RNA was isolated from the stomach tissue, later purified with DNAase and then reverse transcribed to cDNA. The gene expression levels of Cyp1a1 and cyp2b1 were measured with specific primers and EvaGreen fluorescent marker by RT-qPCR. The thesis focused on the evaluation of technical performance of the used RT-qPCR-method.

According to results, the new AHR-agonist (C2) induced enzyme induction which may be associated with total aversion towards novel chocolate. The previous AHR agonists indicated similar aversion. The CAR-agonist (TPD) failed to elicit chocolate aversion. Aversion seems to be directly related to mechanisms of AHR. The determined gene expression levels of cyp1a1 were pretty reliable (R2=0, 9996). The reliability of the determined gene expression levels of cyp2b1 were mediocre (R2=0, 9879) because the calibration curve lacked sensitivity on most of the sample signals. The melting curve analysis indicated that the Rotor-Gene-qPCR-device required re-calibration.

In future studies, the next step would be maintaining or re-calibrating Rotor-Gene-qPCR-device and performing comparative troubleshooting with melting curve graphs. Further conclusions about molecular mechanism of AHR may be performed with data mining tool such as SPSS statistical analysis software.