Metaboliaentsyymien geeniekspressiotason määritys rotan mahalaukun totaali-RNA:sta RT-qPCR-menetelmällä
Vuorensyrjä, Anssi (2015)
Vuorensyrjä, Anssi
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2015
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2015120419345
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2015120419345
Tiivistelmä
Opinnäytetyön aiheena oli kahden metaboliaentsyymin geeniekspressiotason määrittäminen RT-qPCR-menetelmällä rotan mahalaukun kudoksista. Työ oli osa aryylihiilivetyreseptorin (AHR) ja AHR-agonistien tutkimusta Helsingin yliopiston Eläinlääketieteellisessä tiede-kunnassa, Elintarvikehygienian- ja ympäristöterveyden osastolla.
Dioksiinien vaikutusten tiedetään välittyvän AHR:n kautta ja niistä TCDD:n (2,3,7,8-tetraklooridibentso-p-dioksiini) on huomattu aiheuttavan alhaisilla pitoisuuksilla rotilla aversiota eli vastenmielisyyttä uusia ruoka-aineita kohtaan. Ilmiön yhteydessä on havaittu sytokromi P450:n metaboliaentsyymien (erityisesti cyp1a1) geeniekspressiotasojen muutoksia rotan maksan kudoksissa. Viimeisimmissä jatkotutkimuksissa AHR-agonistin (C2) toksista vaikutusta on tutkittu yhdessä CAR-agonistin (TPD) ja AHR-antagonistin (CH-223191) kanssa rotan mahalaukun kudoksista. Opinnäytetyö perustui viimeisimpiin tutkimuksiin.
Työn tavoitteena oli selvittää, löytyykö rottien aversion ja mahalaukun kudosten geeniekspression väliltä yhteyttä. Mahalaukun kudoksista eristettiin totaali-RNA, joka puhdistettiin DNAasilla ja käännettiin cDNA:ksi. Cyp1a1 ja cyp2b1 metaboliaentsyymigeenien ekspressiota mitattiin spesifeillä alukkeilla käyttäen RT-qPCR-tekniikkaa, jossa käytettiin fluoresoivaa EvaGreen-väriainetta. Opinnäytetyössä arvioitiin metaboliaentsyymien geeniekspressiotasojen määrittämisen onnistumista erityisesti tekniseltä kannalta.
Tulosten mukaan uusi AHR-agonisti (C2) aiheutti rotissa entsyymi-induktiota, mikä saattaa olla yhteydessä aversioon suklaalle. Samankaltaista aversiota ovat aiheuttaneet myös aiemmin tutkitut AHR-agonistit. Puolestaan CAR-agonistilla (TPD) ei vastaavaa vaikutusta ilmennyt ollenkaan. Aversio näyttää liittyvän suoranaisesti AHR:n toimintaan. Cyp1a1 metaboliaentsyymigeenin ekspressiotasot määritettiin melko luotettavasti (R2=0,9996). Cyp2b1 metaboliaentsyymigeenin ekspressiotasot olivat luotettavuudeltaan välttäviä (R2=0,9879), koska kalibrointisuoran sensitiivisyys ei riittänyt kaikkien näytteiden pitoisuusalueelle. Sulamiskäyräanalyysien perusteella havaittiin myös mahdollisesti vikaa Rotor-Gene-laitteen kalibroinnissa.
Tutkimuksia voidaan jatkaa huoltamalla tai kalibroimalla Rotor-Gene-laite, jolloin mahdollisesti laitteesta johtuva vika saataisiin paikannettua vertaamalla sulamiskäyräanalyysejä. Päätelmiä AHR:n molekulaarisesta mekanismista voidaan tehdä analysoimalla tuloksia tilastollisesti esimerkiksi SPSS-ohjelmalla.
Dioksiinien vaikutusten tiedetään välittyvän AHR:n kautta ja niistä TCDD:n (2,3,7,8-tetraklooridibentso-p-dioksiini) on huomattu aiheuttavan alhaisilla pitoisuuksilla rotilla aversiota eli vastenmielisyyttä uusia ruoka-aineita kohtaan. Ilmiön yhteydessä on havaittu sytokromi P450:n metaboliaentsyymien (erityisesti cyp1a1) geeniekspressiotasojen muutoksia rotan maksan kudoksissa. Viimeisimmissä jatkotutkimuksissa AHR-agonistin (C2) toksista vaikutusta on tutkittu yhdessä CAR-agonistin (TPD) ja AHR-antagonistin (CH-223191) kanssa rotan mahalaukun kudoksista. Opinnäytetyö perustui viimeisimpiin tutkimuksiin.
Työn tavoitteena oli selvittää, löytyykö rottien aversion ja mahalaukun kudosten geeniekspression väliltä yhteyttä. Mahalaukun kudoksista eristettiin totaali-RNA, joka puhdistettiin DNAasilla ja käännettiin cDNA:ksi. Cyp1a1 ja cyp2b1 metaboliaentsyymigeenien ekspressiota mitattiin spesifeillä alukkeilla käyttäen RT-qPCR-tekniikkaa, jossa käytettiin fluoresoivaa EvaGreen-väriainetta. Opinnäytetyössä arvioitiin metaboliaentsyymien geeniekspressiotasojen määrittämisen onnistumista erityisesti tekniseltä kannalta.
Tulosten mukaan uusi AHR-agonisti (C2) aiheutti rotissa entsyymi-induktiota, mikä saattaa olla yhteydessä aversioon suklaalle. Samankaltaista aversiota ovat aiheuttaneet myös aiemmin tutkitut AHR-agonistit. Puolestaan CAR-agonistilla (TPD) ei vastaavaa vaikutusta ilmennyt ollenkaan. Aversio näyttää liittyvän suoranaisesti AHR:n toimintaan. Cyp1a1 metaboliaentsyymigeenin ekspressiotasot määritettiin melko luotettavasti (R2=0,9996). Cyp2b1 metaboliaentsyymigeenin ekspressiotasot olivat luotettavuudeltaan välttäviä (R2=0,9879), koska kalibrointisuoran sensitiivisyys ei riittänyt kaikkien näytteiden pitoisuusalueelle. Sulamiskäyräanalyysien perusteella havaittiin myös mahdollisesti vikaa Rotor-Gene-laitteen kalibroinnissa.
Tutkimuksia voidaan jatkaa huoltamalla tai kalibroimalla Rotor-Gene-laite, jolloin mahdollisesti laitteesta johtuva vika saataisiin paikannettua vertaamalla sulamiskäyräanalyysejä. Päätelmiä AHR:n molekulaarisesta mekanismista voidaan tehdä analysoimalla tuloksia tilastollisesti esimerkiksi SPSS-ohjelmalla.