Angiopoietiinin kaltaisen proteiini 8:n määritysmenetelmän kehittäminen

Abstract

Angiopoietiinin kaltainen proteiini 8 (ANGPTL8) on hiljattain tunnistettu proteiini. ANGPTL8:n tarkka fysiologinen rooli on toistaiseksi huonosti tunnettu, mutta sillä tiedetään olevan vaikutuksia muun muassa rasva-aineenvaihdunnassa. Se pystyy inhiboimaan lipoproteiinilipaasin toimintaa, joka on tärkeä verenkierron entsyymi triglyseridien hajottamisessa elimistön käyttöön. Häiriöt rasva-aineenvaihdunnassa eli dyslipidemiat, kasvattavat riskiä sairastua sydän- ja verisuonisairauksiin. Nämä sairaudet ovat merkittävimpiä kuolinsyitä koko maailmassa, joten uusia keinoja niiden hoitoon tarvitaan.

ANGPTL8-pitoisuuden määritykseen on tällä hetkellä olemassa kaksi kaupallista ELISA-testiä, jotka antavat keskenään erittäin poikkeavia tuloksia herättäen kysymyksen niiden luotettavuudesta. ANGPTL8:n ristiriitaiset tutkimustulokset voivat johtua näiden eri menetelmien käytöstä. Menetelmän kehittämisen haasteena on ANGPTL8:n mahdollinen hajoaminen ja kompleksoituminen verenkierrossa. Luotettavan määritysmenetelmän kehittäminen on välttämätöntä, jotta ANGPTL8:n vaikutuksia elimistössä ja mahdollista käyttöä dyslipidemian biomarkkerina voidaan tutkia.

Opinnäytetyössä suunniteltiin ja kehitettiin entsyymi-immunologinen ELISA-menetelmä ANGPTL8:n määrittämiseksi THL:n tutkimusryhmän eri hankkeisiin. Menetelmää lähdettiin kehittämään tutkimalla erilaisia vasta-aineyhdistelmiä. Kehitystyössä käytettiin ANGPTL8:n peptideillä immunisoitujen kanien puhdistettuja vasta-aineita. Optimaaliset olosuhteet menetelmälle pyrittiin löytämään vaihtelemalla ELISA-menetelmän eri komponentteja.

Hyvän vasteen antavat vasta-aineet, jotka tunnistavat spesifisesti ANGPTL8:n, onnistuttiin löytämään ja menetelmän olosuhteet optimoimaan. Tutkimuksissa todettiin myös, että ANGPTL8:n esiintyi suureen kompleksiin sitoutuneena niin plasma- kuin seeruminäytteissä. Menetelmän kehittäminen jäi kesken, koska primaarista standardia ei ollut saatavilla. Seuraava askel kehittämistyössä on luotettavan standardin löytäminen ja menetelmän validointi.

Angiopoietin-like protein 8 (ANGPTL8) is a novel member of angiopoietin-like protein family. Its physical functions are so far poorly known, but research has found it having influence on lipid metabolism. Protein inhibits lipoprotein lipase activity and prevents triglyceride hydrolysis in the body. Lipid metabolism disorders (dyslipidemia) increases risk of cardiovascular diseases which are among the main causes of death globally. New methods for curing these diseases are therefore needed.

At the moment, there are two commercial enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for measuring ANGPTL8. Problem is the discrepancies between these two methods which may explain the ANGPTL8’s controversial research results. It is possible, that ANGPTL8 is cleaved and forms large complexes in the blood stream. These things make it challenging to develop a reliable method which is needed to investigate proteins function and use as a biomarker for dyslipidemia.

The goal of this study was to plan and develop enzyme-immunological ELISA-method for measuring ANGPTL8 for THL’s research groups use in different projects. We started to develop the method by testing different antibody combinations. Antibodies that we used in the method were from rabbits that were immunized for ANGPTL8 peptides. We tried to find optimal conditions for the method by changing different components of ELISA.

We were able to find well responding and specifically ANGPTL8 recognizing antibodies and optimal conditions for the method. We also discovered that ANGPTL8 was in large complexes in serum and plasma samples. It was impossible to complete the ELISA development, because we did not have primary standard. Next step is to find reliable standard and validate the method.