Testing of the Recommended Operating Procedures (ROPs) for central nervous system acting chemicals

Abstract

In this thesis Recommended Operating Procedures (ROPs) were tested for sample preparation, analysis, screening and identification of central nervous system (CNS) acting chemicals, a class of incapacitating chemical agents (ICAs), in wipe samples. The selected candidate chemicals were CNS acting drugs: fentanyl, naloxone and amphetamine. The sample preparation was based on extraction of analytes from spiked wipe samples successively with organic solvent and aqueous solvent. Two different organic solvents, dichloromethane and acetone, and three different wipe materials, cotton swab, Whatman filter paper and cotton wipe, were used in the ROP testing experiments. Acetone provided high recoveries for the candidate chemicals whereas dichloromethane extracted the analytes poorly. Relatively high recoveries were achieved with water extraction performed after the extraction with dichloromethane.

Screening and identification of the candidate chemicals in cotton wipe were performed by using both liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC–ESI-MS/MS) and gas chromatography-mass spectrometry (GC–MS). AMDIS software was utilized in GC–MS screening. The LC–MS/MS screening was targeted screening using full scan mode and multiple reaction monitoring (MRM). Both GC–MS and LC–MS/MS techniques and the tested ROPs were evaluated to be valid for screening and identification of the chemicals in question at parts-per-million (ppm, µg/g) concentration levels. From these two analysis techniques, the LC–MS/MS was found to be more appropriate technique for analysis of the candidate chemicals.

In addition to the wipe sample study, a quantitative method for determining fentanyl in urine by LC–ESI–MS/MS was validated. The assay was based on extraction of fentanyl from human urine using solid phase extraction (SPE). Deuterium labeled fentanyl-d5 was used as internal standard in quantitation. Validation of the method was studied in the concentration range of 0.5–50 ng/ml. The validation experiments were carried out by preparing and analyzing three replicate calibration standards at seven different concentration levels each day during three days. Limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) were determined to be 0.5 ng/ml. The accuracy ranged from -1.2 to 14.3 % and the intermediate precision from 2.7 to 6.1 %. The extraction recovery of fentanyl was determined to be 83.8 and 90.1 % at concentration levels of 1 and 25 ng/ml, respectively.

Tässä opinnäytetyössä testattiin kemiallisten aseiden analysointiin, seulontaan ja tunnistamiseen tarkoitettuja menetelmiä (Recommended Operating Procedure, ROP) keskushermostoon vaikuttaville yhdisteille, jotka kuuluvat inkapasitoivien kemiallisten aineiden piiriin. Kokeissa käytettäväksi näytematriisiksi valittiin pyyhintänäytteet ja tutkittaviksi aineiksi keskushermostoon vaikuttavia yhdisteitä: fentanyyli, naloksoni sekä amfetamiini. Näytteenkäsittely perustui pyyhintänäytteen uuttamiseen ensin orgaanisella liuottimella ja tämän jälkeen vedellä. Vertailtaviksi orgaanisiksi uuttoliuottimiksi valittiin dikloorimetaani sekä asetoni ja kokeita suoritettiin kolmelle eri pyyhintänäytemateriaalille: Whatman-suodatinpaperille, vanupuikolle sekä puuvillaliinalle. Asetonilla uutettaessa saavutettiin huomattavasti suuremmat saannot valituille analyyteille kuin dikloorimetaanilla. Saannot olivat myös suhteellisen korkeita vesifraktioissa, jotka olivat uutettu dikloorimetaaniuuton jälkeen.

Valittuja yhdisteitä seulottiin ja tunnistettiin pyyhintänäyteuutteista käyttäen sekä nestekromatografia-sähkösumutusionisaatio-tandem-massaspektrometriaa (LC–ESI–MS/MS) että kaasukromatografia-massaspektrometriaa (GC–MS). GC–MS-seulonnassa ja -tunnistuksessa hyödynnettiin AMDIS-tietokoneohjelmaa. LC–MS/MS -seulonta perustui tunnettujen yhdisteiden etsimiseen käyttäen full scan- ja MRM-menetelmää. GC–MS- ja LC–MS/MS-tekniikoiden sekä ROP-menetelmien todettiin olevan soveltuvia valittujen yhdisteiden seulontaan ja tunnistamiseen miljoonasosa-konsentraatiotasolla (ppm, µg/g). Analyysitekniikoista LC–MS/MS osoittautui soveltuvammaksi valittujen yhdisteiden analysointiin.

Pyyhintänäytekokeiden lisäksi tässä työssä validoitiin menetelmä fentanyylin määrittämiseksi virtsasta LC–ESI–MS/MS-tekniikalla. Menetelmän näytteenkäsittely perustui analyyttien uuttamiseen virtsasta kiinteäfaasiuutolla isotooppileimatun fentanyyli-d5:n toimiessa sisäisenä standardina kvantitoinnissa. Validointi suoritettiin pitoisuusalueella 0,5–50 ng/ml fentanyyliä virtsassa. Validointia varten valmistettiin ja analysoitiin kolme rinnakkaista näytettä seitsemällä eri pitoisuustasolla päivittäin kolmen päivän ajan. Havaitsemis- ja määritysrajan (LOD ja LOQ) todettiin olevan 0,5 ng/ml fentanyyliä virtsassa. Mittausten tarkkuus vaihteli -1,2 ja 14,3 %:n välillä ja täsmällisyys 2,7 ja 6,1 %:n välillä. Fentanyylin saannoksi kiinteäfaasiuutosta määritettiin 83,8 % pitoisuustasolla 1 ng/ml ja 90,1 % pitoisuustasolla 25 ng/ml.