Master mix -reagenssiseoksen testaus qPCR:ää varten

Abstract

HLA-laboratoriossa tehdyn työn tarkoituksena oli löytää uusi master mix -reagenssiseos vanhan mixin tilalle qPCR-ajoihin. qPCR-menetelmää käytettiin potilasnäytteillä tehtäviin tutkimuksiin, joissa selvitettiin tiettyjä HLA-alueen geenejä (HLA eli Human Leucosyte An-tigen), jotka liittyvät erilaisiin tulehdus- ja autoimmuunisairauksiin kuten nivelreumaan ja sepelvaltimotautiin.

Master mix sisältää kaikki nukleotidit, puskuriliuoksen, entsyymin ja muita komponentteja, joita qPCR-reaktiot vaativat. Ainoastaan templaatti-DNA, sekä alukkeet puuttuvat. Testeihin valittiin 3 eri valmistajan kaupallista master mixiä (PerfeCTa, Brilliant III, FastStart). Potilasaineistosta valittiin joukko positiivisia ja negatiivisia näytteitä ajoja varten.

Testaukset aloitettiin testaamalla mixit ensin yhden tutkimuksen suhteen (HLA-C4B -geeni) optimiolojen löytämiseksi. Johtuen master mixien erilaisista ominaisuuksista, FastStart testattiin erikseen. Optimin löytämisen jälkeen testattiin loput geeniajot mixeillä eri reaktio-olosuhteissa. Näiden ensimmäisten testausten aikana FastStart pudotettiin pois, sillä Per-feCTa ja Brilliant III olivat nopeampia ja toimivat samoissa olosuhteissa. Testikierroksen jälkeen myös Brilliant III jätettiin pois ja lisätestaukset tehtiin pelkällä PerfeCTalla.

Toinen testikierros tehtiin ensimmäisen testikierroksen perusteella valituissa ajo-olosuhteissa. Ajoissa oli mukana sekä kontrolleja, että uusia potilasnäytteitä. Tulokset varmistettiin vielä vanhalla mixillä.

Lopuksi voitiin todeta, että Perfecta toimi jopa paremmin kuin vanha mix ja antoi samat tulokset (positiivinen kahdella tai yhdellä geenikopiolla tai negatiivinen). Se myös toimii nopeammin kuin vanha mix, minkä vuoksi qPCR-ajo on 30 minuuttia lyhyempi.

The purpose of the thesis was to find a new master mix for quantitative PCR (qPCR) to replace an old discontinued master mix. qPCR was used for testing patient samples for various HLA genes related to some inflammatory and autoimmune diseases (reactive ar-thritis, rheumatism, coronary artery syndromes). The master mix contains all nucleotides, buffer, enzyme and other ingredients needed for reactions excluding DNA template and primers. 3 different kinds of commercial master mixes were selected for trials (PerfeCTa, Brilliant III, FastStart). Some previously tested patient samples were selected as positive and negative controls.

The testing started with finding optimal qPCR conditions for one test (HLA-C4-B -gene test). Due to different kind of features between master mixes FastStart was tested sepa-rately. After optimization other gene tests were tested with all mixes in different reaction conditions (small changes in time and temperature). During the trials FastStart was dropped off and only PerfeCTa and Brilliant III stayed, which could be tested in the same conditions. When both mixes were tested at least once with every gene test, PerfeCTa was selected for extra tests.

After the first trial, PerfeCTa was selected for second trial variation runs, with reaction con-ditions based on the first trials results. In variation runs, controls from first trial and unknown patient samples were tested with the old master mix and PerfeCTa and the results were compared with each other.

In conclusion, PerfeCTa performs even better than the old master mix and gives the same results (positive, double positive, negative). It also performs faster than the old mix and, therefore, the qPCR run is 30 minutes shorter than with the old mix.