Kapillaariseen isoelektriseen fokusointiin perustuvan analyysimenetelmän kehittäminen ja validointi

Abstract

Monoklonaaliset vasta-aineet ovat nousseet viime vuosina merkittäviksi terapeuttisina proteiineina sekä diagnostiikassa. Monoklonaalisia vasta-aineita käytetään erityisesti syöpien ja autoimmuunitautien hoidossa. Kasvamassa oleva terapeuttisten vasta-aineiden määrä lisää tarvetta myös tehokkaille analyysimenetelmille vasta-aineiden karakterisoimiseksi. Pienetkin muutokset vasta-aineen monimutkaisessa rakenteessa voivat vaikuttaa olennaisesti valmisteen tehoon ja turvallisuuteen.

Opinnäytetyö tehtiin Yliopiston Apteekin analyyttisessa laboratoriossa. Työn tarkoituksena oli kehittää kapillaariseen isoelektriseen fokusointiin (cIEF) perustuva analyysimenetelmä monoklonaalisten vasta-aineiden varausten heterogeenisyyden tutkimiseen. Menetelmällä oli tarkoitus korvata perinteinen geelillä ajettava isoelektrinen fokusointi (IEF) monoklonaalisten vasta-aineiden rutiinianalytiikassa. Lisäksi tässä opinnäytetyössä haluttiin vertailla cIEF:n ja kapillaarivyöhyke-elektroforeesin (CZE) soveltuvuutta monoklonaalisten vasta-aineiden varausprofiilien tutkimiseen. Menetelmien pystyttämisen jälkeen validoitiin molemmat menetelmät ja tulosten perusteella arvioitiin menetelmien vahvuuksia ja heikkouksia.

CZE:n etuna oli yksinkertaisempi näytteenkäsittely ja pienemmät analyysikustannukset kuin cIEF:ssä. cIEF:llä saadaan kuitenkin vasta-aineen varausprofiilin lisäksi selville myös isoformien pI-arvot, mikä ei ole mahdollista CZE:llä. Migraatioaikojen toistettavuudessa oli ongelmia molemmilla menetelmillä, mutta CZE:llä migraatioaikojen toistettavuus oli hieman parempi. cIEF-menetelmällä saatiin kuitenkin toistettavia pI-arvoja, kun käytettiin sisäisenä standardina pI-markkereita.

Validoinnin tulosten perusteella molemmat menetelmät soveltuvat aiottuun käyttötarkoitukseen. cIEF:llä ja CZE:llä saatuja tuloksia ei voi verrata suoraan toisiinsa, koska menetelmät antavat erilaista tietoa vasta-aineen ominaisuuksista. Yhdessä muiden analyysimenetelmien kanssa cIEF ja CZE ovat tehokkaita työkaluja monoklonaalisten vasta-aineiden karakterisointiin.

Monoclonal antibodies have become increasingly significant as therapeutic proteins and diagnostic tools over the last few years. Monoclonal antibodies are used in particular to treat cancers and autoimmune diseases. The growing number of therapeutic monoclonal antibodies also increases the need for powerful analytical methods to characterize monoclonal antibodies. Even very small changes in the structure of a monoclonal antibody could compromise the effectiveness and safety of a therapeutic product.

The thesis was done in the analytical laboratory of University Pharmacy. The aim of this thesis was to develop a capillary isoelectric focusing method (cIEF) for the analysis of monoclonal antibody charge variants. The purpose of the cIEF method was to replace the traditional gel isoelectric focusing (IEF) as a routine analytical method for monoclonal antibodies. Additionally, the cIEF method and a capillary zone electrophoresis (CZE) method were compered with each with respect to their suitability for the analysis of monoclonal antibody charge variants. After method set ups both methods were validated. The validation results were used to evaluate benefits and flaws of both methods.

The most significant benefits of CZE compared to cIEF were simpler sample preparation and lower cost of analysis. However, with cIEF it is possible to obtain information about the pI values of different isoforms, which is not possible with CZE. The repeatability of the migration times was problematic in both methods, but repeatability was a little better in CZE. On the other hand, good repeatability of the pI values was achieved with cIEF when pI markers were used as internal standards.

The validation results indicate that both methods are suitable for intended use. Results obtained from cIEF and CZE are not fully comparable because the methods give information about different properties of the monoclonal antibody. Together with other analytical methods, cIEF and CZE are powerful tools for the characterization of monoclonal antibodies.