Reaaliaikaisen qPCR-menetelmän kehittäminen tuotekehityksen referenssimenetelmäksi patogeeniselle Yersinia enterocoliticalle

Abstract

Yersinia enterocolitca on jääkaappiolosuhteissa viihtyvä, elintarvikeperäisten gastroenteriittien kolmanneksi yleisin taudinaiheuttaja koko Euroopassa. Yersinioiden aiheuttaman, jopa kaksi viikkoa kestävän, yersinioosiksi kutsutun suolistoinfektion oireisiin kuuluvat kuume, kovat vatsakivut ja ripuli. Y.enterocolitica tunnistetaan kliinisistä ulostenäytteistä viljelemällä tai PCR-menetelmällä, mutta sen haastava viljeltävyys, apatogeenisten kantojen antamat väärät positiiviset viljetytulokset ja plasmidikato voivat johtaa virheelliseen diagnoosiin.

Tämän opinnäytetyön tarkoituksena oli kehittää Orion Diagnostica Oy:n tuotekehitysosastolle uuden testimenetelmän kehittämisen avuksi referenssimenetelmä Y.enterocolitica baktee-rin tunnistamiseen. Tavoitteena oli saada kaupallisen referenssimenetelmän rinnalle kahdesta kolmeen eri virulenssigeeneille suunniteltua PCR-menetelmää, joilla patogeeniset kannat voitaisiin tunnistaa spesifisesti.

Työtä varten tehtiin kirjallisuuskatsaus, jonka pohjalta lähdettiin testaamaan useita valmiita Yersinioille suunniteltuja PCR-menetelmiä. Kun tarpeeksi spesifiseen ja herkkään tulokseen ei näillä menetelmillä päästy, alettiin tarvetta vastaavaa menetelmää suunnittelemaan itse.

Reaaliaikaisen qPCR-referenssimenetelmän kehittäminen aloitettiin suunnittelemalla alukkeet patogeenisille Y.enterocolitica-bakteerikannoille spesifiselle ail-geenialueelle. Suunniteltuja alukkeita testattiin ja sopivimmat valittiin mukaan menetelmän optimointiin. Optimoidulle menetelmälle tehtiin kantakattavuus- ja ristireaktiotestit, joissa pyrittiin viitteellisesti arvioimaan testin spesifisyyttä ja herkkyyttä. Lopuksi menetelmää testattiin vielä kliinisillä uloste-näytteillä.

Opinnäytetyön kokeellisen osuuden aikana onnistuttiin kehittämään patogeenisten Y.enterocolitica-kantojen tunnistamiseen sopiva herkkä, reaaliaikainen qPCR-menetelmä. Koska käytössä ei ollut yhtään Yersinia-positiiviseksi todettua kliinistä ulostenäytettä, ei menetelmän toimivuutta kliinisten näytteiden osalta voitu varmistaa. Kliinisiä ulostenäytteitä testattaessa kahdeksan näytteen kohdalla kuitenkin ilmeni epäspesifistä monistumista, minkä osalta selvitystyötä on vielä jatkettava. Näytteenottomuodon havaittiin saattavan vaikuttaa sekä kehitetyllä menetelmällä saataviin tuloksiin että referenssimenetelmän kehityksessä käytetyn kaupallisen referenssimenetelmän antamiin tuloksiin.

Yersinia entrocolitca is an enteropathogenic bacteria which thrives in refrigerator temperatures and is the third most common cause of food borne infections. It causes an intestinal infection called yersiniosis, which can last up to two weeks. To the symptoms belong fever, strong abdominal pain and diarrhea. Y.enterocolitica is commonly detected from fecal samples by culturing methods or by PCR methods. Different challenges in culturing meth-ods, like plasmid loss and appearance of non-pathogenic strains, may lead to misdiagnosis.

This thesis was conducted at the Research and Development Department of Orion Diagnostica Oy. The purpose of this thesis was to setup two or three reference PCR methods for detection of pathogenic Y.enterocolitica. The aim was to find sensitive and specific PCR methods that could detect different virulence genes of pathogenic strains. Several PCR assays from the literature were tested, and when none of the tested assays were sensitive or specific enough, an assay was designed.

The development of a PCR-based reference method was initiated by designing of the primers for the ail-gene, which is specific for pathogenic bacterial strains of Y.enterocolitica. The primers were tested and the most suitable primers were chosen for optimization of the Real-Time qPCR. The optimized method was tested for strain coverage and cross reactivity, which were used to estimate the specificity and sensitivity of the method. Last the method was tested with clinical fecal samples.

During the experimental part of this thesis, a sensitive Real-Time qPCR method for detec-tion of pathogenic Y.enterocolitica was developed. Because no Yersinia-positive samples were available, the effectiveness of the approach in clinical samples couldn't be proven. Eight clinical fecal samples showed unspecific amplification, in which more research work must be done. Also while testing clinical fecal samples, it was noticed that sampling methods could have an effect on the results and reproducibility of the reference methods, used in the product development.