Kitinaasien tuotto Trichoderma reesei -homeessa

Abstract

Tämä insinöörityö tehtiin yhteistyössä Roal Oy:n T&K-osaston kanssa. Tarkoituksena oli löytää kitinaaseja, joita Roal Oy voisi tulevaisuudessa hyödyntää teollisessa tuotannossaan.

Kitinaasit ovat hydrolyyttisiä entsyymejä, jotka pilkkovat kitiiniä hajottamalla sen N-asetyyliglukosaminiyksiköiden välisiä β-1,4-glykosidisidoksia. Kitiini on luonnossa runsaasti esiintyvä polymeeri. Sitä on paljon esimerkiksi äyriäisten ja hyönteisten tukirangoissa sekä homeiden soluseinissä.

Tämän työn tavoitteena oli kloonata kitinaasigeenejä homeen genomista ja tuottaa niiden koodittamia kitinaaseja Trichoderma reesei -homeessa. Työhön kuului kitinaasituottokasettien rakentaminen, niiden transformointi tuottoisäntään, transformanttien kasvatus ja valitun kitinaasin ominaisuuksien alustava karakterisointi tuottokannan kasvuliuoksesta. Lisäksi työssä testattiin analyysimenetelmiä, joilla kitinaasien aktiivisuuksia ja ominaisuuksia voidaan tutkia.

Tässä työssä kitinaasigeenejä kloonattiin kuusi kappaletta, joista neljän koodaamat kitinaasientsyymit tuottuivat T. reesei -homeesta. Proteiinien erittyminen kasvuliuokseen todennettiin SDS-PAGE-analyysillä. Yhden hyvin tuottuvan kitinaasin, Chi18-13:n, ominai-suudet analysoitiin. Työssä määritettiin Chi18-13:n pH- ja lämpötilaoptimit sekä sen spesifisyys pienikokoisille kitiinisubstraateille.

Tulokset osoittavat, että Chi18-13:n pH-optimi on välillä 3 - 4 ja lämpötilaoptimi välillä 50 - 60 °C. Chi18-13 hajottaa kitosaania, ja sillä on sekä endo- että eksokitinaasiaktiivisuutta. Tuotettujen kitinaasien karakterisointia jatketaan Roal Oy:ssä parhaiten teolliseen käyttöön soveltuvien kitinaasien löytämiseksi. Lisäksi analyysimenetelmien kehittämistä jatketaan, jotta löydetään soveltuvimmat menetelmät erilaisten kitinaasien ominaisuuksien määrittämiseksi ja kitinaasien välisten synergioiden selvittämiseksi.

This thesis was done in collaboration with the R&D department of Roal Oy. The aim of Roal is to find chitinases which can be exploited in the future industrial production.

Chitinases are hydrolytic enzymes that degrade chitin by cleaving the β-1,4-glycosidic bonds between its structural N-acetylglucosamine units. Chitin is an abundant natural polymer. It is found, for example, in the exoskeletons of crustaceans and insects and in the fungal cell walls.

The aim of this thesis was to clone chitinase genes from the genome of a filamentous fungus, and to produce the encoded chitinases in Trichoderma reesei. The work included construction of chitinase expression cassettes, transformation of the cassettes into the host, cultivations of the transformants, and initial characterization of a selected chitinase. In addition, analytical methods were tested for examination of chitinase activities and features.

In this thesis, six individual chitinase genes were cloned and expressed in T. reesei. Four out of these six chitinases could be produced by the host. The production of enzymes was verified by SDS -PAGE analysis. In this thesis, one of the chitinases, Chi 18-13, was characterized for its specificity for small chitin substrates and its pH and temperature optimal were defined.

According to the results obtained the pH optimum of the Chi18-13 is between 3 and 4, and the temperature optimum is between 50 and 60 °C. Chi18-13 can degrade chitosan and has both endo- and exochitinase activity. The characterization of the produced chitinases will continue at Roal Oy in order to identify the best suited chitinases for industrial use. In addition, the development of the analytical methods will continue to screen for the most appropriate methods to characterize various chitinases and their synergies with each other.