Kitinaasien tuotto Trichoderma reesei -homeessa
Koskela, Emmi (2016)
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201604275165
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201604275165
Tiivistelmä
Tämä insinöörityö tehtiin yhteistyössä Roal Oy:n T&K-osaston kanssa. Tarkoituksena oli löytää kitinaaseja, joita Roal Oy voisi tulevaisuudessa hyödyntää teollisessa tuotannossaan.
Kitinaasit ovat hydrolyyttisiä entsyymejä, jotka pilkkovat kitiiniä hajottamalla sen N-asetyyliglukosaminiyksiköiden välisiä β-1,4-glykosidisidoksia. Kitiini on luonnossa runsaasti esiintyvä polymeeri. Sitä on paljon esimerkiksi äyriäisten ja hyönteisten tukirangoissa sekä homeiden soluseinissä.
Tämän työn tavoitteena oli kloonata kitinaasigeenejä homeen genomista ja tuottaa niiden koodittamia kitinaaseja Trichoderma reesei -homeessa. Työhön kuului kitinaasituottokasettien rakentaminen, niiden transformointi tuottoisäntään, transformanttien kasvatus ja valitun kitinaasin ominaisuuksien alustava karakterisointi tuottokannan kasvuliuoksesta. Lisäksi työssä testattiin analyysimenetelmiä, joilla kitinaasien aktiivisuuksia ja ominaisuuksia voidaan tutkia.
Tässä työssä kitinaasigeenejä kloonattiin kuusi kappaletta, joista neljän koodaamat kitinaasientsyymit tuottuivat T. reesei -homeesta. Proteiinien erittyminen kasvuliuokseen todennettiin SDS-PAGE-analyysillä. Yhden hyvin tuottuvan kitinaasin, Chi18-13:n, ominai-suudet analysoitiin. Työssä määritettiin Chi18-13:n pH- ja lämpötilaoptimit sekä sen spesifisyys pienikokoisille kitiinisubstraateille.
Tulokset osoittavat, että Chi18-13:n pH-optimi on välillä 3 - 4 ja lämpötilaoptimi välillä 50 - 60 °C. Chi18-13 hajottaa kitosaania, ja sillä on sekä endo- että eksokitinaasiaktiivisuutta.
Tuotettujen kitinaasien karakterisointia jatketaan Roal Oy:ssä parhaiten teolliseen käyttöön soveltuvien kitinaasien löytämiseksi. Lisäksi analyysimenetelmien kehittämistä jatketaan, jotta löydetään soveltuvimmat menetelmät erilaisten kitinaasien ominaisuuksien määrittämiseksi ja kitinaasien välisten synergioiden selvittämiseksi.
Kitinaasit ovat hydrolyyttisiä entsyymejä, jotka pilkkovat kitiiniä hajottamalla sen N-asetyyliglukosaminiyksiköiden välisiä β-1,4-glykosidisidoksia. Kitiini on luonnossa runsaasti esiintyvä polymeeri. Sitä on paljon esimerkiksi äyriäisten ja hyönteisten tukirangoissa sekä homeiden soluseinissä.
Tämän työn tavoitteena oli kloonata kitinaasigeenejä homeen genomista ja tuottaa niiden koodittamia kitinaaseja Trichoderma reesei -homeessa. Työhön kuului kitinaasituottokasettien rakentaminen, niiden transformointi tuottoisäntään, transformanttien kasvatus ja valitun kitinaasin ominaisuuksien alustava karakterisointi tuottokannan kasvuliuoksesta. Lisäksi työssä testattiin analyysimenetelmiä, joilla kitinaasien aktiivisuuksia ja ominaisuuksia voidaan tutkia.
Tässä työssä kitinaasigeenejä kloonattiin kuusi kappaletta, joista neljän koodaamat kitinaasientsyymit tuottuivat T. reesei -homeesta. Proteiinien erittyminen kasvuliuokseen todennettiin SDS-PAGE-analyysillä. Yhden hyvin tuottuvan kitinaasin, Chi18-13:n, ominai-suudet analysoitiin. Työssä määritettiin Chi18-13:n pH- ja lämpötilaoptimit sekä sen spesifisyys pienikokoisille kitiinisubstraateille.
Tulokset osoittavat, että Chi18-13:n pH-optimi on välillä 3 - 4 ja lämpötilaoptimi välillä 50 - 60 °C. Chi18-13 hajottaa kitosaania, ja sillä on sekä endo- että eksokitinaasiaktiivisuutta.
Tuotettujen kitinaasien karakterisointia jatketaan Roal Oy:ssä parhaiten teolliseen käyttöön soveltuvien kitinaasien löytämiseksi. Lisäksi analyysimenetelmien kehittämistä jatketaan, jotta löydetään soveltuvimmat menetelmät erilaisten kitinaasien ominaisuuksien määrittämiseksi ja kitinaasien välisten synergioiden selvittämiseksi.