Transgeenisten Arabidopsis-kasvien proteiinianalyyttinen seulonta E3-ligaasitutkimusta varten

Abstract

Opinnäytetyö tehtiin osana Helsingin yliopiston maa- ja metsätaloustieteellisen tiedekunnan tutkimusryhmän projektia ”The characterization of Flower related Ubiquitin Proteasome System in Arabidopsis”. Tutkimusryhmän projektin tarkoituksena on tutkia miten kasvin ubikitiini-proteasomijärjestelmän komponentit vaikuttavat kasvien kehitykseen.

Opinnäytetyön tarkoituksena oli seuloa transgeenisiä Arabidopsis thaliana-kasveja tulevia tutkimuksia varten. Seulottavia linjoja käytetään tutkimuksissa joissa tutkitaan proteiini-proteiini-interaktioita E3-ligaasien ja niiden hypoteettisten ubikitinaatiokohteiden välillä.

Opinnäytetyön aikana kasvatettiin aiemmin tuotettujen transgeenisten kasvien siemenet, jonka jälkeen tuotettujen rekombinanttiproteiinien ekspressio varmistettiin immunoblottauksen avulla. Vain ne linjat, joissa insertoitu DNA voitiin havaita proteiinitasolla, ovat käyttökelpoisia jatkotutkimuksia varten. Seulottavat linjat erosivat toisistaan niiden sisältämien modifikaatioiden (nukleotidien substituution tai domeenin deleetion), käytettyjen proteiini-merkkien, käytettyjen vektorien ja kasvien taustan (joko villityyppi tai mutantti) mukaan. Samasta insertiolinjasta seulottiin useampi kasvilinja, jotta ainakin yksi niistä olisi käyttökelpoinen.

Opinnäytetyön toteutuksen aikana käytettiin seuraavia laboratoriomenetelmiä. Selektiomaljojen valmistus, siementen keräys, sterilointi ja viljely, segregaatioanalyysi, proteasomi-inhibiittori-käsittely, kasviproteiinien eristys, proteiinipitoisuuksien määrittäminen Bradfordin menetelmän avulla sekä proteiininäytteiden SDS-PAGE ja Western Blot.

Suurimmasta osasta tutkituista insertiolinjoista saatiin ainakin yksi linja, jota voidaan käyttää tulevaisuudessa jatkotutkimuksiin. Linjojen perusteella voidaan tutkia vaikuttaako tietyn E3-ligaasin yliekspressio tai ekspression puute sen ubikitinaatiokohteen ekspressioon ja siten myös sen aktiivisuuteen kasvisolussa ja miten tämä vaikuttaa kasvin kehitykseen ja sen fenotyyppiin.

This thesis is a part of a project conducted at the University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry, Department of Agricultural Sciences. The name of the project is ”The characterization of Flower related Ubiquitin Proteasome System in Arabidopsis” and its goal is to determine the components in plants ubiquitin proteasome pathway and to find out what is their part in the plants development.

The purpose of this study was to screen genetically modified Arabidopsis thaliana plants in order to find suitable lines for future experiments. The screened lines are used to elucidate protein-protein interactions between E3-ligases and their hypothesized ubiquitination targets.

Seeds of the transgenic plants were grown in vitro and afterwards the expression of the produced recombinant proteins was verified with the use of immunoblotting. Only the plant lines in which the expression of the inserted DNA could be detected on protein level are useful in the planned future experiments. Various screened lines differed from each other in their modifications (nucleotide substitutions or domain deletions), the used amino acid tags, the used vectors and the plant background (wild type or mutant). More than one plant line was screened from a single insertion line so that at least one of the lines could be used in the future experiments.

During the thesis work, the following laboratory work was performed. Preparation of the selection media, seed collection, sterilization and sowing, segregation analysis, proteasome inhibitor treatment, plant protein extraction, protein quantification with Bradford-measurement and SDS-PAGE and Western Blotting of the protein extracts.

At least one useful line was discovered from most of the insertion lines. The screened lines can be used to see if the over expression or the lack of expression of a specific E3-ligase will affect the expression of its ubiquitination target and thus its activity inside the plant cell and how this affects the plants development and its phenotype.