Transgeenisten Arabidopsis-kasvien proteiinianalyyttinen seulonta E3-ligaasitutkimusta varten
Leinonen, Matti (2016)
Leinonen, Matti
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2016
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201605096735
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201605096735
Tiivistelmä
Opinnäytetyö tehtiin osana Helsingin yliopiston maa- ja metsätaloustieteellisen tiedekunnan tutkimusryhmän projektia ”The characterization of Flower related Ubiquitin Proteasome System in Arabidopsis”. Tutkimusryhmän projektin tarkoituksena on tutkia miten kasvin ubikitiini-proteasomijärjestelmän komponentit vaikuttavat kasvien kehitykseen.
Opinnäytetyön tarkoituksena oli seuloa transgeenisiä Arabidopsis thaliana-kasveja tulevia tutkimuksia varten. Seulottavia linjoja käytetään tutkimuksissa joissa tutkitaan proteiini-proteiini-interaktioita E3-ligaasien ja niiden hypoteettisten ubikitinaatiokohteiden välillä.
Opinnäytetyön aikana kasvatettiin aiemmin tuotettujen transgeenisten kasvien siemenet, jonka jälkeen tuotettujen rekombinanttiproteiinien ekspressio varmistettiin immunoblottauksen avulla. Vain ne linjat, joissa insertoitu DNA voitiin havaita proteiinitasolla, ovat käyttökelpoisia jatkotutkimuksia varten. Seulottavat linjat erosivat toisistaan niiden sisältämien modifikaatioiden (nukleotidien substituution tai domeenin deleetion), käytettyjen proteiini-merkkien, käytettyjen vektorien ja kasvien taustan (joko villityyppi tai mutantti) mukaan. Samasta insertiolinjasta seulottiin useampi kasvilinja, jotta ainakin yksi niistä olisi käyttökelpoinen.
Opinnäytetyön toteutuksen aikana käytettiin seuraavia laboratoriomenetelmiä. Selektiomaljojen valmistus, siementen keräys, sterilointi ja viljely, segregaatioanalyysi, proteasomi-inhibiittori-käsittely, kasviproteiinien eristys, proteiinipitoisuuksien määrittäminen Bradfordin menetelmän avulla sekä proteiininäytteiden SDS-PAGE ja Western Blot.
Suurimmasta osasta tutkituista insertiolinjoista saatiin ainakin yksi linja, jota voidaan käyttää tulevaisuudessa jatkotutkimuksiin. Linjojen perusteella voidaan tutkia vaikuttaako tietyn E3-ligaasin yliekspressio tai ekspression puute sen ubikitinaatiokohteen ekspressioon ja siten myös sen aktiivisuuteen kasvisolussa ja miten tämä vaikuttaa kasvin kehitykseen ja sen fenotyyppiin.
Opinnäytetyön tarkoituksena oli seuloa transgeenisiä Arabidopsis thaliana-kasveja tulevia tutkimuksia varten. Seulottavia linjoja käytetään tutkimuksissa joissa tutkitaan proteiini-proteiini-interaktioita E3-ligaasien ja niiden hypoteettisten ubikitinaatiokohteiden välillä.
Opinnäytetyön aikana kasvatettiin aiemmin tuotettujen transgeenisten kasvien siemenet, jonka jälkeen tuotettujen rekombinanttiproteiinien ekspressio varmistettiin immunoblottauksen avulla. Vain ne linjat, joissa insertoitu DNA voitiin havaita proteiinitasolla, ovat käyttökelpoisia jatkotutkimuksia varten. Seulottavat linjat erosivat toisistaan niiden sisältämien modifikaatioiden (nukleotidien substituution tai domeenin deleetion), käytettyjen proteiini-merkkien, käytettyjen vektorien ja kasvien taustan (joko villityyppi tai mutantti) mukaan. Samasta insertiolinjasta seulottiin useampi kasvilinja, jotta ainakin yksi niistä olisi käyttökelpoinen.
Opinnäytetyön toteutuksen aikana käytettiin seuraavia laboratoriomenetelmiä. Selektiomaljojen valmistus, siementen keräys, sterilointi ja viljely, segregaatioanalyysi, proteasomi-inhibiittori-käsittely, kasviproteiinien eristys, proteiinipitoisuuksien määrittäminen Bradfordin menetelmän avulla sekä proteiininäytteiden SDS-PAGE ja Western Blot.
Suurimmasta osasta tutkituista insertiolinjoista saatiin ainakin yksi linja, jota voidaan käyttää tulevaisuudessa jatkotutkimuksiin. Linjojen perusteella voidaan tutkia vaikuttaako tietyn E3-ligaasin yliekspressio tai ekspression puute sen ubikitinaatiokohteen ekspressioon ja siten myös sen aktiivisuuteen kasvisolussa ja miten tämä vaikuttaa kasvin kehitykseen ja sen fenotyyppiin.