Tripeptidin IPP:n kvantitointimenetelmän kehitys eri HPLC-kolonneilla sekä yhdisteen varmistus MALDI:lla ja ESI/MS:llä

Abstract

Työ suoritettiin Helsingin yliopiston Medicumin Lääketieteellisillä laitoksilla, Kliinisen Proteomiikan yksikössä, Helsinki, Suomi. Tripeptidi isoleusyyliprolyyliproliini (IPP) määritys kuuluu Farmakologian yksikön tutkimuksiin, jossa pyritään löytämään terveyteen suotuisasti vaikuttavia ruoka-aineita. Tripeptidi on pooliton ja hyvin hydrofobinen joka tekee sen ongelmallinen erotettavaksi kromatografian keinoin (peptidin heikon interaktion kolonnin matriisin kanssa).

Työn tarkoituksena oli löytää sopiva protokolla IPP:n kromatografiseen analyysiin. Käytännössä kokeiltiin useita eri kolonneja joita kokeiltiin eri kromatografisissa olosuhteissa. Kokeet suoritettiin kahdella eri kromatografialaitteella SMART (entinen Pharmacia) ja ÄKTA flpc (GE Healthcare Life Sciences). MALDI-TOF:lla ja sähkösumutusionisaatiomassaspektrometreillä (Bruker Daltonics) varmennettiin tripeptidi.

Työssä käytettiin kahta päätyyppiä olevia kolonneja, nimittäin käänteisfaasikromatografiassa (RPC) end capping muokatuilla oktadekyylisilanolikolonneja (C18) ja paljas silikapartikkeli kolonneja HILIC:ssä. Käytetyt puskurit olivat asetonitriilipohjaisia. Puskurin pH säätöön käytettiin trifluorietikkahappoa (TFA, 0,1 %), 20 mM ammoniumformaattia (pH 10) tai 10 mM ammoniumformaattia (pH 4,5) jota käytettiin HILIC kromatografiaan. Kolonneista oli kolme ODS- ja kolme HILIC -kolonneja

Paras erotus saatiin yhdistelmällä Watersin X Bridge -kolonnilla (C18) 20 mM ammoniumformaattia (pH 10) ja SMART -laitteistolla. Peptidi eluoitui kapeana vyöhykkeenä virtauksen ollessa 0,1 ml/min isokraattisella gradientilla. Watersin HILIC SILICA -kolonni ja 10 mM ammoniumformaatti puskurin (pH 4,5) tulokset vaikuttivat lupaavilta ja saatuja tuloksia voidaan hyödyntää tulevissa tutkimuksissa.

Valittiin IPP tripeptidin erottumiseen ja kvantitointiin kaksi RP C18 -kolonnia (Watersin X Bridge ja Kinetexin EVO) käytettäväksi joko happamalla tai emäksisellä puskurilla. Näillä olosuhteilla voitiin luotettavasti erottaa ja kvantitoida 0,1 µg synteettistä peptidiä. Samankaltaisia tuloksia saatiin IPP:n rotan suolen läpäisevyyspilottitutkimuksessa (yhteistyössä Prof. Riitta Korpelan ryhmän kanssa, Farmakologian osastolta).

The practical work of this thesis was performed at the Meilahti Clinical Proteomic Core Facility; Medicum, Faculty of Medicine, University of Helsinki, Finland. The tripeptide isoleucine-proline-proline (IPP), has been studied at the Department of Pharmacology, in research projects related to general nutrition. The tripeptide is non-polar and heavily hydrophobic, which makes it problematic in chromatographic resolutions (poor interaction with the column matrix).

The aim of this thesis project was to establish a suitable protocol for chromatographic analysis of IPP. In practice, several different analytical columns and chromatographic con-ditions were utilized in the thesis project. The experiments were performed using SMART (former Pharmacia) and ÄKTA fplc (GE Healthcare Life Sciences) chromatography systems. MALDI-TOF and electrospray ionization mass spectrometry (Bruker Daltonics) was used to verify the identity/quantity of tripeptide.

In this thesis project, two types of matrices, namely end-capped octadecylsilane (ODS, C18) in reverse-phase (RP) and plain silica in HILIC type chromatography, were utilized. As mobile phase, acetonitrile-based buffers were used. For pH alterations, either trifluoroacetic acid (TFA, 0.1%), 20 mM ammonium formate (pH 10) or 10 mM ammonium formate (pH 4.5) for HILIC chromatography were used. Three types of ODS and three HILIC silica columns were tested for resolving the IPP.

The best resolution was achieved with the Waters X Bridge column (C18), using 20 mM ammonium formate buffer (pH 10) and the SMART system. The peptide eluted as a narrow peak with the flow 0.1 ml/minute, and in isocratic conditions. Waters HILIC SILICA column and ammonium formate (pH 4.5) gave promising results, which can be utilized in the future studies.

As the final recommendation for chromatographic resolving of IPP tripeptide, two RP C18 columns were chosen (Waters X Bridge column and Kinetex EVO), operating with either acidic or alkaline buffers. Approximately 0.1 µg of synthetic peptide could be resolved and quantified in these conditions. Similar results were gained in pilot experiments with IPP crossing the rat gut barrier (in collaboration with Prof. Riitta Korpela’s group, Dept. of Pharmacology).