Proteiinit biomimeettisissä komposiittimateriaaleissa ja niiden biotekninen tuotto homeessa

Abstract

Opinnäytetyön tavoitteena oli selvittää nanokomposiittimateriaaleissa käytettävien fuusio-proteiinien tuottamista homeisännässä. Fuusioproteiinien konstruktiot koostuivat materiaaleihin sitoutuvista yksiköistä sekä materiaalin joustavuuteen vaikuttavista yksiköstä. Geenien kloonaus suoritettiin käyttämällä yhden reaktion Golden Gate -menetelmää ja konstruktiot transformoitiin partikkelipommituksella Trichoderma reesei -homeeseen. Fuusioproteiinit tuotettiin solusta erittyvinä ja solun sisäisesti tuotettuna eri tilavuuksissa ja erilaisia kasvatusalustoja käyttäen. Proteiinien puhdistusta varten selvitettiin erilaisia menetelmiä kuten liukoisuuskäsittelyä, kaksifaasiuuttoa, preparatiivista käänteisfaasikromatografia ja affiniteettikromatografia. Analysointiin käytettiin SDS-PAGE-ajoa, Western blot-analyysiä, korkean erotuskyvyn nestekromatografia-ajoa ja matriisiavusteista laserdesorptioionisaatio -määritystä. Työssä saatiin aikaan halutut geenikonstruktiot ja hometransformantit, jotka tuottivat tutkittavaa fuusioproteiinia. Proteiinien tuottotasot jäivät kuitenkin melko alhaisiksi, ja näytteissä oli havaittavissa proteaasipilkkoutumista. Eri menetelmiä käyttäen onnistuttiin puhdistamaan ja analysoimaan fuusioproteiinit. Proteiinien alhaisten tuottotasojen vuoksi puhdistaminen käytetyillä menetelmillä osoittautui haastavaksi. Solun sisäisesti tuottuva resiliini-yksikön sisältävä konstruktio todettiin parhaaksi tuottumisen ja puhdistumisen osalta. Tutkimusta jatketaan selvittämällä erilaisten materiaalisovelluksiin käytettävien proteiinikonstruktien tuottamista homeessa sekä niiden vaikutusta materiaalien mekaanisiin ominaisuuksiin.

The aim of the thesis was to study the expression of fusion proteins used in nanocomposite materials in fungal host. The fusion protein constructs contained material binding domains and elastic domains. Gene cloning was performed using the single reaction Golden Gate -method. Transformation of the fungus Trichoderma reesei was achieved by DNA-coated small particles and micro projectile bombardment. The fusion proteins were secreted to the culture medium or expressed intracellularly in various volumes and using different culture mediums. Purification of the proteins was studied by solubility assays, aqueous two-phase system extraction, reversed-phase chromatography and affinity chromatography. Methods used for the analysis were SDS-PAGE, western blotting, high performance liquid chromatography and matrix-assisted laser desorption ionization. In the study, the planned gene constructs and fungal transformants expressing the target proteins were achieved. However, the expression yields were rather low and protein degradation was observed. The fusion proteins were purified and analyzed using various methods. Purification of proteins proved to be challenging because of the low expression levels. Expression of fusion protein containing a resilin unit intracellularly was most successful in terms of expression levels and purification. The focus of future studies will be on the production of different material specific fusion proteins in fungi and the impact of these proteins on the mechanical properties of the materials they form.