Arabidopsis thalianan genomin muokkaus CRISPR/Cas-tekniikalla
Mäki, Mikko (2016)
Mäki, Mikko
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2016
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2016060311734
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2016060311734
Tiivistelmä
Opinnäytetyö suoritettiin Helsingin yliopiston Bio- ja ympäristötieteiden laitoksen kasvibiologian osastolle osana laajempaa tutkimusprojektia. Työn tarkoituksena oli yrittää muokata kohdennetusti osa Arabidopsis thalianan DNA:ta CRISPR/Cas9-tekniikalla. Tulosten selvittämiseen käytettiin nested PCR–metodia yhdistettynä T7E1 endonukleaasikäsittelyyn.
CRISPR/Cas9 on uusi, vuonna 2012 kehitetty genomien muokkaamisen työkalu. Siinä käytetään ohjelmoitua sgRNA:ta ja Cas9-entsyymiä paikantamaan haluttu kohta genomista, kiinnittymään siihen ja leikkaamaan DNA:n molemmat juosteet poikki. Tällä tavalla voidaan aiheuttaa mutaatioita DNA:n korjausmekanismien liittäessä juosteiden päät uudelleen yhteen. Tällä tekniikalla on myös mahdollista leikata pala DNA -ketjusta pois yhdistämällä kaksi sgRNA ohjaussekvenssiä yhden siirtogeenisen plasmidin sisään ja transformoimalla kasvit tällä yhdistelmäplasmidilla. Leikattuun kohtaan voidaan tämän jälkeen liittää uusi pätkä DNA:ta ja täten muuttaa genomia. Tekniikka mahdollistaa esimerkiksi solujen ohjelmoimista ja mahdollisesti perinnöllisten sairauksien hoitamista.
Työssä käytetyt CRISPR-konstrukteilla transformoidut T0-siemenet kasvatettiin selektiomaljoilla, joilla ne pystyivät kasvamaan niihin siirtyneen resistenssigeenin avulla. Tämän jälkeen siemenet istutettiin multaan, ja niistä kerättiin muutaman viikon ikäisinä lehtinäytteet. Lehtinäytteistä valmistettiin DNA-näytteitä kloroformi-uutto -tekniikalla. DNA-näytteet monistettiin PCR:llä ja sen jälkeen ne digestoitiin T7E1-endonukleaasin avulla.
Työssä ei onnistuttu löytämään yhtäkään positiivista tulosta T7E1-metodilla, mutta sekvensoimalla löydettiin yksi kasvilinja, jossa oli tapahtunut geenin editio. Tämä todistaa alkuperäisen CRISPR-käsittelyn onnistuneen. Koska mahdollisia syitä heikolle onnistumiselle on monia, vaatii CRISPR-menetelmä vielä optimointia ja lisätutkimuksia.
CRISPR/Cas9 on uusi, vuonna 2012 kehitetty genomien muokkaamisen työkalu. Siinä käytetään ohjelmoitua sgRNA:ta ja Cas9-entsyymiä paikantamaan haluttu kohta genomista, kiinnittymään siihen ja leikkaamaan DNA:n molemmat juosteet poikki. Tällä tavalla voidaan aiheuttaa mutaatioita DNA:n korjausmekanismien liittäessä juosteiden päät uudelleen yhteen. Tällä tekniikalla on myös mahdollista leikata pala DNA -ketjusta pois yhdistämällä kaksi sgRNA ohjaussekvenssiä yhden siirtogeenisen plasmidin sisään ja transformoimalla kasvit tällä yhdistelmäplasmidilla. Leikattuun kohtaan voidaan tämän jälkeen liittää uusi pätkä DNA:ta ja täten muuttaa genomia. Tekniikka mahdollistaa esimerkiksi solujen ohjelmoimista ja mahdollisesti perinnöllisten sairauksien hoitamista.
Työssä käytetyt CRISPR-konstrukteilla transformoidut T0-siemenet kasvatettiin selektiomaljoilla, joilla ne pystyivät kasvamaan niihin siirtyneen resistenssigeenin avulla. Tämän jälkeen siemenet istutettiin multaan, ja niistä kerättiin muutaman viikon ikäisinä lehtinäytteet. Lehtinäytteistä valmistettiin DNA-näytteitä kloroformi-uutto -tekniikalla. DNA-näytteet monistettiin PCR:llä ja sen jälkeen ne digestoitiin T7E1-endonukleaasin avulla.
Työssä ei onnistuttu löytämään yhtäkään positiivista tulosta T7E1-metodilla, mutta sekvensoimalla löydettiin yksi kasvilinja, jossa oli tapahtunut geenin editio. Tämä todistaa alkuperäisen CRISPR-käsittelyn onnistuneen. Koska mahdollisia syitä heikolle onnistumiselle on monia, vaatii CRISPR-menetelmä vielä optimointia ja lisätutkimuksia.