Teollisen entsyymin kiteytysmenetelmän optimointi

Abstract

Kiteytyksellä on pitkät perinteet proteiinien, erityisesti entsyymien puhdistuksessa. Menetelmä on optimoituna sekä tehokas että edullinen tapa erottaa haluttuja entsyymejä liuoksesta. Lisäetuina kiteytys mahdollistaa väkevien entsyymiformulaatioiden valmistamisen, stabiilimman entsyymin ja yleensä helpon siirtymisen suurempaan mittakaavaan (scale-up).

Työn tavoitteena oli löytää yhdelle valitulle entsyymille sellaiset olosuhteet, joissa kiteytyminen olisi mahdollisimman tehokasta; tarkoituksena oli käyttää kiteytystä entsyymin puhdistamiseen suoraan fermentointiliemestä. Työn aikana ilmenneiden haasteiden vuoksi alustavaa suunnitelmaa jouduttiin muokkaamaan työn edetessä, minkä seurauksena yhden entsyymin sijasta kiteytysolosuhteiden optimointia tehtiin lopulta neljälle entsyymille. Syitä tähän olivat ennalta-arvaamattomat entsyymin kiteytymiseen ja aktiivisuuden analysointiin liittyvät ongelmat. Salassapidon vuoksi käytettyjä entsyymejä ei voida työssä tarkemmin esitellä vaan niihin viitataan ainoastaan entsyymeinä, jotka on eroteltu toisistaan koodilla (A, B, C ja D).

Entsyymien kiteytyvyyttä tutkittiin ensin hanging drop -menetelmällä ja myöhemmin pienen mittakaavan panoskiteytyskokeina. Lisäksi kiteiden liukoisuutta tutkittiin pH:n, lämpötilan ja saostinpitoisuuden funktiona. Tulosten perusteella entsyymille D saatiin piirrettyä liukoisuuskäyriä, joiden avulla nähtiin kyseiselle entsyymille optimaalisimmat kiteytysolosuhteet.

Entsyymille D saadaan lähes 100 %:n laskennallinen kidesaanto pH-välillä 7,1—7,6, kun suolapitoisuus (Na-K-fosfaattipitoisuus) on välillä 0,6—1,0 M tai vaihtoehtoisesti pH-välillä 6,0—6,4, kun suolapitoisuus on 1 M. Selvitetyt kiteytymisolosuhteet eivät ole vielä riittävät varsinaista kiteytysprosessia varten, mutta tarjoavat hyvän pohjan lisätutkimukselle.

Crystallization has long traditions in purification of proteins, especially enzymes. When optimized, crystallization is an efficient and inexpensive way to separate desired enzymes from a solution. Crystallization also enables highly concentrated formulation products, more stabile enzyme and usually easy scale-up, which can be concidered as additional benefits.

The purpose of this thesis was to find as optimized circumstances as possible to crystallize the desired enzyme. The plan was to use crystallization as a purification method straight from the fermentation liquid. Due to challenges, which occurred during the experiments, the original plan had to be modified. As a result, four entzymes were submitted to crystallization experiments instead of one. Main reasons for this were unexpected complexities in enzyme crystallization and enzyme activity analysis. The used enzymes will not be further introduced, but they will be referred as enzymes with letter codes ( A, B, C and D) on account of the confidentiality contract.

The crystallization of the enzymes were first examined by the hanging drop method and later as small scale batch crystallization experiments. Also the solubility of the crystals was examined as a function of pH, temperature and precipitant concentration.

The computational crystal yield, almost 100%, is reached when the pH is between 7.1—7.6, when the salt concentration (sodium potassium phosphate concentration) is between 0.6—1.0 M, or, optionally, when the pH is between 6.0—6.4 and the salt concentration is 1 M. The examined crystallization circumstances are not adequate enough to create a final crystallization process, but they supply a good base for further research.