Teollisen entsyymin kiteytysmenetelmän optimointi
Kaivonen, Elina (2016)
Kaivonen, Elina
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2016
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2016060211633
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2016060211633
Tiivistelmä
Kiteytyksellä on pitkät perinteet proteiinien, erityisesti entsyymien puhdistuksessa. Menetelmä on optimoituna sekä tehokas että edullinen tapa erottaa haluttuja entsyymejä liuoksesta. Lisäetuina kiteytys mahdollistaa väkevien entsyymiformulaatioiden valmistamisen, stabiilimman entsyymin ja yleensä helpon siirtymisen suurempaan mittakaavaan (scale-up).
Työn tavoitteena oli löytää yhdelle valitulle entsyymille sellaiset olosuhteet, joissa kiteytyminen olisi mahdollisimman tehokasta; tarkoituksena oli käyttää kiteytystä entsyymin puhdistamiseen suoraan fermentointiliemestä. Työn aikana ilmenneiden haasteiden vuoksi alustavaa suunnitelmaa jouduttiin muokkaamaan työn edetessä, minkä seurauksena yhden entsyymin sijasta kiteytysolosuhteiden optimointia tehtiin lopulta neljälle entsyymille. Syitä tähän olivat ennalta-arvaamattomat entsyymin kiteytymiseen ja aktiivisuuden analysointiin liittyvät ongelmat. Salassapidon vuoksi käytettyjä entsyymejä ei voida työssä tarkemmin esitellä vaan niihin viitataan ainoastaan entsyymeinä, jotka on eroteltu toisistaan koodilla (A, B, C ja D).
Entsyymien kiteytyvyyttä tutkittiin ensin hanging drop -menetelmällä ja myöhemmin pienen mittakaavan panoskiteytyskokeina. Lisäksi kiteiden liukoisuutta tutkittiin pH:n, lämpötilan ja saostinpitoisuuden funktiona. Tulosten perusteella entsyymille D saatiin piirrettyä liukoisuuskäyriä, joiden avulla nähtiin kyseiselle entsyymille optimaalisimmat kiteytysolosuhteet.
Entsyymille D saadaan lähes 100 %:n laskennallinen kidesaanto pH-välillä 7,1—7,6, kun suolapitoisuus (Na-K-fosfaattipitoisuus) on välillä 0,6—1,0 M tai vaihtoehtoisesti pH-välillä 6,0—6,4, kun suolapitoisuus on 1 M. Selvitetyt kiteytymisolosuhteet eivät ole vielä riittävät varsinaista kiteytysprosessia varten, mutta tarjoavat hyvän pohjan lisätutkimukselle.
Työn tavoitteena oli löytää yhdelle valitulle entsyymille sellaiset olosuhteet, joissa kiteytyminen olisi mahdollisimman tehokasta; tarkoituksena oli käyttää kiteytystä entsyymin puhdistamiseen suoraan fermentointiliemestä. Työn aikana ilmenneiden haasteiden vuoksi alustavaa suunnitelmaa jouduttiin muokkaamaan työn edetessä, minkä seurauksena yhden entsyymin sijasta kiteytysolosuhteiden optimointia tehtiin lopulta neljälle entsyymille. Syitä tähän olivat ennalta-arvaamattomat entsyymin kiteytymiseen ja aktiivisuuden analysointiin liittyvät ongelmat. Salassapidon vuoksi käytettyjä entsyymejä ei voida työssä tarkemmin esitellä vaan niihin viitataan ainoastaan entsyymeinä, jotka on eroteltu toisistaan koodilla (A, B, C ja D).
Entsyymien kiteytyvyyttä tutkittiin ensin hanging drop -menetelmällä ja myöhemmin pienen mittakaavan panoskiteytyskokeina. Lisäksi kiteiden liukoisuutta tutkittiin pH:n, lämpötilan ja saostinpitoisuuden funktiona. Tulosten perusteella entsyymille D saatiin piirrettyä liukoisuuskäyriä, joiden avulla nähtiin kyseiselle entsyymille optimaalisimmat kiteytysolosuhteet.
Entsyymille D saadaan lähes 100 %:n laskennallinen kidesaanto pH-välillä 7,1—7,6, kun suolapitoisuus (Na-K-fosfaattipitoisuus) on välillä 0,6—1,0 M tai vaihtoehtoisesti pH-välillä 6,0—6,4, kun suolapitoisuus on 1 M. Selvitetyt kiteytymisolosuhteet eivät ole vielä riittävät varsinaista kiteytysprosessia varten, mutta tarjoavat hyvän pohjan lisätutkimukselle.