Use of Viability PCR in Food Pathogen Diagnostics

Abstract

This study was conducted for Thermo Fisher Scientific aiming to the development of a method for the exclusive detection of viable bacteria from food samples, using viability PCR. Real-time PCR (qPCR) is readily used in food diagnostics for its speed, simplicity and specificity. However, the method lacks the ability to differentiate between viable and dead pathogens. To exclude the signals originating from dead cells, dyes that penetrate compromised cell membranes and have a high affinity to bind covalently to nucleic acids are used to inhibit the amplification of DNA modified by the dye.

In this study the function of two commercially available viability dyes was evaluated with both genomic DNA and cells. The dye’s specificity and the contribution of different factors on inhibition efficiency were analyzed in order to find the most optimal conditions for efficient dead-cell signal suppression. The effect of dye and sample concentration and composition, incubation and photoactivation conditions, amplicon length and detection chemistry used were evaluated.

The experiments showed that the inhibition of dead-cell signals was incomplete with one amplicon routinely used in pathogen detection. The length of target amplicon was observed to significantly affect the efficiency of viability dye and the detection rate of dead-cell DNA was also highly dependent on the qPCR detection chemistry used. The results suggested that low reagent concentration was the most effective when suppressing signals from cells. A longer amplicon and an elongated photoactivation period could further enhance the inhibition efficiency.

The results obtained show that by increasing the amplicon length, using a low dye concentration and further optimizing the PCR protocol, efficient inhibition of dead-cell DNA could be achieved in food matrices.

Tämä opinnäytetyö tehtiin Thermo Fisher Scientificille tavoitteena kehittää viability PCR -menetelmä ainoastaan elävien bakteerien havaitsemiseksi ruokanäytteistä. Reaaliaikainen PCR (qPCR) on elintarvikediagnostiikassa yleisesti käytetty tekniikka sen nopeuden, yksinkertaisuuden ja spesifisyyden vuoksi. Menetelmä ei kuitenkaan kykene erottelemaan eläviä patogeenejä kuolleista. Kuolleista soluista saatavien signaalien hiljentämiseksi on kehitetty väriaineita, jotka läpäisevät vahingoittuneen bakteerin solukalvon ja sitoutuvat kovalenttisesti nukleiinihappoihin estäen niiden monistumisen qPCR:ssä.

Tässä työssä vertailtiin kahden kaupallisen värin toimintaa genomisella DNA:lla ja soluilla. Värin spesifisyyttä ja eri tekijöiden vaikutusta tehokkuuteen arvioitiin optimaalisten reaktio-olosuhteiden löytämiseksi. Työssä tutkittiin konsentraatioiden ja näytteen koostumuksen, inkubaatio- ja fotoaktivaatio-olosuhteiden, amplikonin pituuden ja detektiokemian vaikutusta DNA:n inhibointitehokkuuteen.

Kokeet osoittivat menetelmän tehokkuuden olevan riittämätön yhdellä elintarvikediagnostiikassa rutiininomaisesti käytetyllä amplikonilla. Kohdeamplikonin pituuden huomattiin vaikuttavan merkittävästi värin inhibointikykyyn. Myös käytetyllä detektiokemialla oli vaikutusta kuolleista soluista peräisin olevan DNA:n detektiomääriin. Tulokset osoittivat, että alhainen reagenssipitoisuus oli tehokkain käyttäessä soluja. Pidempi amplikoni yhdessä pidennetyn fotoaktivaatiovaiheen kanssa voisi parantaa tehokkuutta edelleen.

Saatujen tulosten perusteella kuolleiden solujen signaalien inhibointi olisi mahdollista ruokanäytteillä. Menetelmän tehokkuutta voisi parantaa kasvattamalla detektoitavan amplikonin pituutta, käyttämällä alhaisempaa reagenssikonsentraatiota ja edelleen optimoimalla PCR protokollan parametrejä.