Hevosarteriitti viruksen Real Time RT-PCR -menetelmän käyttöönotto ja validointi

Abstract

Opinnäytetyö suoritettiin Eläintautivirologian tutkimusyksikössä Elintarviketurvallisuusviras-to Evirassa. Työn tavoitteena oli ottaa käyttöön ja validoida reaali-aikainen RT-PCR-menetelmä (rRT-PCR) hevosen arteriittivirukselle (equine arteritis virus, EAV) käytössä olevan perinteisen RT-PCR-menetelmän tilalle. Nykyaikainen rRT-PCR-menetelmä vähen-täisi työvaiheita ja nopeuttaisi diagnostiikkaa.

Validointia varten valmistettiin laimennossarjoja arteriittiviruskannoista Arvac ja Bucyrus eri matriiseihin. Lisäksi validoinnissa käytettiin vuosien 2009, 2013 ja 2016 EU-referenssilaboratorion toimittamia vertailumittausnäytteitä. Ensimmäiseksi testattiin mene-telmän toimivuus CFX-96™ Real Time PCR -laitteella, sekä varmistettiin DNA-sekvensointitekniikalla, että monistettava kohta on oikeaa viruksen genomista aluetta.

Laimennossarjoista saatiin laskettua variaatiokerroin (CV), joka kertoo tulosten uusittavuu-desta ja toistettavuudesta. Vuosien 2009, 2013 ja 2016 vertailumittausnäytteistä menetel-mällä saatiin yhtenevät tulokset referenssilaboratorion tulosten kanssa.

Sekvensoinnin tulokset olivat selkeitä vaikkakin PCR-tuotteen pituus on vain 204 emäspa-rin mittainen, mikä voi aiheuttaa ongelmia sekvensoinnissa. Menetelmällä saadaan monis-tettua oikeaa kohtaa viruksen genomista (ORF7). Laimennossarjojen avulla laskettu variaa-tiokerroin oli hyvä. Suurilla laimennoksilla tulos heikkeni, sillä viruksen RNA:n vähentyessä näytteessä myös todennäköisyys PCR-reaktion onnistumiselle pienenee.

Evira on FINAS-akkreditoitu testauslaboratorio ja tässä työssä validoitu menetelmä tullaan liittämään osaksi Eläintautivirologian tutkimusyksikössä käytössä olevia akkreditoituja diag-nostisia PCR-menetelmiä.

The aim of the project was to implement and validate a diagnostic real-time RT-PCR meth-od (rRT-PCR) for equine arteritis virus (EAV). The project was carried out at the Veterinary Virology Research Unit of the Finnish Food Safety Authority Evira.

The method was qualitative rRT-PCR which means the results are either positive or nega-tive. Validation parameters were sensitivity, specificity and accuracy, which were deter-mined using samples received from the European Union Reference Laboratory for profi-ciency testing. Two EAV strains Arvac and Bucyrus, were used in the validation. The virus-es were diluted in four different matrices, including organ suspension, nasal discharge, cell culture medium and semen.

The new rRT-PCR method for EAV was successfully implemented and validated with ex-cellent results from the dilution series, different matrices and proficiency test samples. The coefficient of variation (CV) was calculated from the cycle threshold (Ct) – values. The CV-values ranged from 0.5 to 4.5 %, which is acceptable for a PCR method. Based on the re-sults obtained, the EAV rRT-PCR -method is repeatable within and between runs.

Evira is a testing laboratory accredited by the Finnish Accreditation Service FINAS (ISO/IEC 17025 standard). The validated EAV rRT-PCR -method will be included to the accredited diagnostic PCR-methods used in the Veterinary Virology Research Unit and the rRT-PCR method is going to replace the traditional RT-PCR method in EAV diagnostics. Compared to traditional RT-PCR, rRT-PCR is faster, there is no need for gel electrophore-sis in the visualization of results, and the risk of contamination is lower.