Noroviruksen analysointi Droplet Digital PCR -laitteella ja inhibition vaikutuksen vertaaminen Droplet Digital PCR:n ja reaaliaikaisen PCR:n välillä norovirusanalyysissä

Abstract

Opinnäytetyössä testattiin norovirusanalyysin toimivuutta uudenlaisella Droplet Digital PCR -laitteella (ddPCR), joka soveltuu nukleiinihappojen kvantitatiiviseen määritykseen. Analyysin toimivuutta testattiin noroviruksen genoryhmillä GI ja GII. Työn tavoitteena oli selvittää, toimiiko analyysi riittävän hyvin ddPCR-laitteella vai onko menetelmää optimoitava ja kuinka herkkä ddPCR-menetelmä on ennestään käytössä olleeseen reaaliaikaiseen PCR-menetelmään (qPCR) verrattuna. Lisäksi työssä tutkittiin, onko näytematriisin aiheuttamalla inhibitiolla vähemmän vaikutusta ddPCR-analyysiin kuin qPCR-analyysiin.

Analyysin toimivuutta ddPCR-laitteella testattiin analysoimalla noroviruksen genoryhmien GI ja GII RNA- ja DNA-näytteitä. ddPCR-analyysi suunniteltiin käytössä olleiden noroviruksen qPCR-analyysien pohjalta. ddPCR-menetelmän herkkyyttä ja inhibition vaikutusta tuloksiin arvioitiin analysoimalla samoja näytteitä ddPCR:llä ja qPCR:llä sekä vertaamalla ddPCR-tuloksia aiemmin samoista näytteistä mitattuihin qPCR-tuloksiin.

Tulosten perusteella ddPCR-analyysi toimi hyvin noroviruksen genoryhmällä GII. Menetelmän herkkyys oli dsDNA-laimennossarjan perusteella arvioituna yhtä hyvä kuin qPCR:llä. Menetelmä toimi myös genoryhmällä GI, mutta suhteellinen herkkyys qPCR:ään verrattuna oli 88 %, eikä ddPCR:llä saatu positiivista tulosta yhtä heikosta dsDNA-laimennoksesta kuin qPCR:llä, joten GI-analyysin optimointi todettiin tarpeelliseksi.

PCR-inhibiittoreilla havaittiin olevan vähemmän vaikutusta ddPCR:llä kuin qPCR:llä määritettyyn NoV GII -pitoisuuteen eli ddPCR oli vähemmän herkkä näytematriisin aiheuttamalle inhibitiolle kuin qPCR, mikä oli odotettua muilla viruksilla aiemmin tehtyjen tutkimusten perusteella.

Noroviruksen analysoinnista ddPCR-laitteella ei ollut ennestään juurikaan tietoa. Työssä saatiin selvitettyä, että ddPCR:ää voidaan tarvittaessa käyttää qPCR:n sijaan ainakin noroviruksen genoryhmän GII analysoinnissa ja että menetelmä toimii myös genoryhmällä GI, mutta halutun herkkyyden saavuttamiseksi NoV GI -menetelmää on syytä optimoida. ddPCR:ää voidaan hyödyntää jatkossa esimerkiksi inhibitorisia näytematriiseja tutkittaessa tai noroviruksen ja referenssimateriaalien kvantitatiivisessa määrityksessä.

In this study, norovirus assay was tested using Droplet Digital PCR (ddPCR) which is a new method for quantifying nucleic acids. The assay was tested with norovirus genogroups GI and GII. The aim of the study was to determine whether the assay worked well or needed optimizing, and to determine relative sensitivity of the assay using ddPCR compared to real-time PCR (qPCR) which has been used in norovirus assays previously. It was also studied if sample matrix related inhibition affected the assay less on ddPCR than qPCR.

The assay was tested by analyzing RNA and DNA samples of norovirus genogroups GI and GII using ddPCR. ddPCR assay was designed based on previously performed norovirus qPCR assays. Sensitivity of the assay and effects of inhibition on the results were estimated by analyzing samples using ddPCR and qPCR and by comparing ddPCR results to previously obtained qPCR results.

The results indicated that ddPCR assay worked well with norovirus genogroup GII. Sensitivity of the assay was as good as with qPCR, based on dsDNA dilution series. The assay worked also with genogroup GI but relative sensitivity was 88 % compared to qPCR and weaker dilution of dsDNA was detected positive using qPCR than ddPCR. Therefore further optimization of GI assay is recommended.

The results showed that PCR inhibitors affected the measured concentration of NoV GII less when analyzed by ddPCR than by qPCR. Thus, ddPCR was less sensitive to inhibition caused by sample matrix than qPCR, which was expected based on previous studies of other viruses.

Prior to this study there was not much information of analyzing norovirus by ddPCR. It was discovered that ddPCR can be used in norovirus assay instead of qPCR, at least with genogroup GII, and that the assay works also with genogroup GI but needs to be optimized to obtain the eligible sensitivity. In the future ddPCR may be used for instance to examine inhibitory samples or to quantify norovirus samples or reference materials.