Detergentteihin pohjautuvan näytteenkäsittelyn kehittäminen noroviruksen nukleiinihappodiagnostiikkaan

Abstract

Tämän opinnäytetyön tarkoituksena oli kehittää detergentteihin pohjautuva näytteenkäsittely noroviruksen nukleiinihappomonistusta varten. Työ tehtiin yhteistyössä Orion Diagnostica Oy:n tuotekehityslaboratorion kanssa. Näytteenkäsittely suunniteltiin yhteensopivaksi Orion Diagnostica Oy:n SIBA®-teknologiaan perustuvien kylmäkuivattujen reagenssien kanssa. Opinnäytetyön kokeellinen osuus koostui näytteenkäsittelyreagenssien vertailusta eri olosuhteissa kaupallisten noroviruskontrollipartikkelien ja ulosteen kanssa. Tavoitteena oli perehtyä näytemateriaalina olevan ulosteen ja RNA-viruksen asettamiin haasteisiin detergentteihin pohjautuvan näytteenkäsittelyn kautta.

Kehittämiseen käytettiin pääasiallisena tutkimustyökaluna RT-PCR-reaktioita, joiden avulla vertailtiin eri tavalla käsiteltyjen noroviruskontrollipartikkelinäytteiden monistumista. Kyse oli alkuvaiheen tuotekehitystyöstä, jonka aikana pyrittiin rajaamaan pois ei-toimivia vaihtoehtoja ja löytämään joukosta noroviruksen näytteenkäsittelyyn optimaalisimmat reagenssit. Opinnäytetyön viimeisessä vaiheessa tutkittiin detergenttikäsiteltyjen näytteiden toimivuutta SIBA®-reaktiossa. Näytemateriaaleina tutkimuksissa käytettiin kaupallisia noroviruskontrollipartikkeleita ja ulostenäytteitä. Kokonaisuudessaan työ koostui suunnittelusta, detergenttien valinnasta ja valmistamisesta, näytteenkäsittelystä, RT-PCR-reaktioiden valmistelusta ja tulosten tulkinnasta sekä käsittelystä dokumentoitavaan muotoon.

Opinnäytetyön kokeellisessa osuudessa tehtiin kattava pohjatyö noroviruksen näytteenkäsittelyprosessille ennen SIBA®-monistusreaktiota. Detergenttien ominaisuuksia tarkasteltiin korkean konsentraation PEG-liuoksen kanssa, jolloin näytteenkäsittelyn toimivuuden huomattiin parantuvan selkeästi. Loppuun valittujen detergenttien tiedetään toimivan noroviruksen näytteenkäsittelyreagensseina norovirusryhmien GI ja GII kanssa. Lisäksi kuumennusvaiheen merkitys ulostenäytteiden näytteenkäsittelyssä tarkentui. Viimeisen vaiheen tutkimuksista SIBA®-reaktiossa parhailta vaikuttivat detergentit Tween 20 ja Brij L23. Opinnäytetyö esittelee kattavasti työn suorituksen sekä tutkimuksista saadut tulokset ja sen teoriatieto on suunniteltu tukemaan työn laboratorio-osuutta.

The purpose of this study was to find detergent based sample preparation for nucleic acid diagnostics of norovirus. The work was done in collaboration with the Orion Diagnostica’s research and development laboratory. Sample preparation was designed to be compatible with lyophilized reagents based Orion Diagnostica’s Strand Invasion Based Amplification (SIBA®) technology. SIBA®-technology is based on isothermal amplification of nucleic acid at a constant temperature. The main goal of this study was compare different sample preparation conditions and reagents.

The main analysis method was reverse transcription PCR. With the help of RT-PCR, different sample preparation reagents and amplification of norovirus were compared under different conditions. The performance of the thesis consisted of early-stage research and development work. During this study, the aim was to define the inoperative options and find the optimal sample preparation reagents for the diagnosis of norovirus. Stool samples and viral particles were used as the sample material for this study. The working part consisted of the design of new work protocols, manufacture of detergents, preparation of the samples and RT-PCR reactions. In addition, the performance of the work consisted of processing the results to documented form.

The practical part of the thesis was done the groundwork for norovirus sample preparation process before the SIBA®-amplification. As a result, the work was complex, which consisted of comparison of detergents in a many different conditions. The behavior of deter-gents with PEG-solution was examined and it was found to improve their performance clearly. Selected detergents were analyzed with both GI and GII norovirus groups. In addition, it was concluded that the handling of the sample for SIBA® reaction requires a heating step. Without it, the stool used in this study inhibits the reaction. The results of this study showed that two most optimal detergents were Tween 20 and Brij L23. The thesis presents a comprehensive view of work methods, the results from studies and the theory is designed to support the thesis laboratory part.