Set up and selection of qRT-PCR kits for the diagnosis of human respiratory syncytial virus and influenza viruses

Abstract

Respiratory syncytial virus (RSV) and influenza viruses are significant human pathogens causing annual epidemics and occasional pandemic outbreaks. Development of novel molecular diagnostics is of high importance in order to better and faster characterize the infection and use appropriate antiviral treatment and thus, prevent from misuse of antibiotics.

Experimental part of this study was executed in Research and Development laboratory of Orion Diagnostica Oy. The aim of this study was to set up several commercially available quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) kits for diagnosis of RSV and influenza viruses. The aim was to select reference method for Orion Diagnostica’s proprietary Strand Invasion Based Amplification (SIBA®) technology.

During this study, six commercially available one-step qRT-PCR kits were compared. In order to measure sensitivity of the assays, viral RNA samples were extracted and quantitated to be used as dilution series during the experiments. Inclusivity and possible cross-reactivity were elucidated by challenging the reactions with other respiratory pathogens from extracted commercial NATtrol™ FLU verification panel. Panel contained 16 different viral or bacterial particles. Lastly, the performance of the qRT-PCR kits was evaluated in order to select the best kits.

In conclusion, from the selected qRT-PCR kits, RealStar® S&T Influenza RT-PCR Kit 3.0 and RealStar® RSV RT-PCR Kit 1.0 (altona Diagnostics) were the most successful based on the results. Variability between the results was significant, up to 67.6 % difference in Ct values was detected between the best and the worst kit. Moreover, cross-reaction between respiratory pathogens occurred. Although it is important to keep in mind, that during this study, all of the kits were used only once. Therefore, to obtain more reliable results, testing with the RealStar® RT-PCR kits should continue. Furthermore, the follow-up step would be to test the kits with samples processed to be used in freeze-dried SIBA® reactions.

Influenssa- ja RS- virukset ovat merkittäviä ihmispatogeeneja, jotka aiheuttavat vuosittaisia epidemioita, ja influenssa A toisinaan pandemioita. Uusien molekyylibiologisten menetelmien kehitys on jatkuvassa nosteessa antiviraalisen hoidon kohdistamiseksi ja antibioottien väärinkäytön vähentämiseksi.

Tämän työn kokeellinen osuus suoritettiin Orion Diagnostica Oy:n tuotekehityslaboratoriossa ja työn tavoitteena oli pystyttää useita kaupallisia kvantitatiivisia käänteiskopiointi-PCR (qRT-PCR) kittejä respiratory syncytial- virukselle (RSV) ja influenssaviruksille. Valituista qRT-PCR kiteistä oli tavoitteena valita sopiva vertailumenetelmä Orion Diagnostica Oy:n isotermaaliselle geenimonistusmenetelmälle, SIBA®:lle (Strand Invasion Based Amplification).

Vertailua varten pystytettiin kuusi kvantitatiivista yksiputkimenetelmään perustunutta qRT-PCR kittiä. qRT-PCR kittien herkkyyttä mitattiin työtä varten eristetyillä virusnäytteillä, jotka kvantitoitiin ja joita käytettiin laimennossarjoina kokeissa. Myös kittien kantakattavuutta ja mahdollisia ristireaktioita testattiin muiden hengitystiepatogeenien kanssa NATtrol™ Flu Verification Panelista eritetyllä RNA:lla. Paneeli sisälsi yhteensä 16 erilaista virus- tai bakteeriperäistä mikrobikontrollia. Lopuksi, saatujen tuloksien perusteella qRT-PCR kittien suorituskykyä arvioitiin parhaimman kitin valitsemiseksi.

Työhön valituista qRT-PCR kiteistä, RealStar® S&T Influenza RT-PCR Kit 3.0 ja RealStar® RSV RT-PCR Kit 1.0 (altona Diagnostics) menestyivät parhaiten. Erot qRT-PCR kittien välillä olivat tilastollisesti merkitseviä, esimerkiksi parhaimpien ja huonoimpien Ct arvojen välinen ero oli jopa 67.6 %. Myös ristireaktioita esiintyi eri hengitystiepatogeenien välillä. Pitää kuitenkin huomioida, että työn aikana jokaista käytettyä qRT-PCR kittiä käytettiin vain kerran ja näin ollen luotettavampien tuloksien saamiseksi olisi hyvä jatkaa testausta etenkin RealStar® RT-PCR kittien kanssa. Jatkossa kokeita voitaisiin myös tehdä näytteillä, jotka on käsitelty käytettäväksi kylmäkuivatuissa SIBA® reaktioissa.