Kokonaisen kudoksen kuvantaminen iDISCO-menetelmällä ja vertailu kudosleikkeisiin

Abstract

Kudoksia on perinteisesti tutkittu valmistamalla ohuita kudosleikkeitä, jotka käsiteltyinä tai käsittelemättöminä on kuvannettu eri mikroskooppisin menetelmin. Näin saadut kaksiulotteiset kuvat ovat helppoja työstää, mutta kokonaiskäsitys esimerkiksi hermoratojen tarkasta rakenteesta ja sijainnista on jäänyt vaillinnaiseksi. Vaihtoehtona kudosleikkeiden valmistamiselle on kokonaisen kudoksen kirkastaminen, vasta-ainekäsittely sekä kuvantaminen.

Tässä opinnäytetyössä keskityttiin tutkimaan kokonaisen kudoksen kirkastamista, vasta-ainekäsittelyä, kuvantamista sekä tekniikkaan liittyviä etuja ja rajoituksia. Tutkimuseläiminä käytettiin hiiriä, joiden PPT-aivoalueelle injisoitiin AAV-CamKlla-hM3Dq-mCherry -virusta. Viruksessa olevan mCherry-väriaineen kulkeutumista aivoissa tutkittiin kirkastamalla kokonaiset aivot iDISCO-menetelmällä, jolloin valotasomikroskooppia käyttämällä saatiin rakennettua kolmiulotteinen malli aivoista sekä havaittua fluoresoivan proteiinin kulkeutuminen. Vertailun vuoksi valmistettiin perinteisiä kudosleikkeitä, joita verrattiin iDISCO-käsiteltyihin aivoihin.

Työ suoritettiin Helsingin yliopiston Farmakologian osastolla ja näytteet kuvattiin Saksan Bonnissa Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen -instituutissa (DZNE).

Traditionally biological tissues have been studied by tissue sectioning followed by microsco-py imaging. These two-dimensional images are easy to produce, but the complete picture of the anatomy and location of neural pathways can be insufficient. An alternative is to use the whole-brain clearing method with immunohistochemistry and imaging.

In this thesis, the focus is on clearing the tissue samples, immunohistochemistry, imaging and comparison to traditional tissue slices. Mouse brains at brain stem PPT region were injected with AAV-CamKIIa-hM3Dq-mCherry -virus and the expression was determined by using mCherry-compatible antibodies. The mouse brains were cleared using the iDISCO-method, and by using a light sheet microscope, a 3D-reconstruction was made to study the projections of the mCherry-protein. Also the advantages and disadvantages of the iDISCO-method were evaluated.

The thesis was done at the Department of Pharmacology in the University of Helsinki, and the samples were imaged at Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen (DZNE) in Bonn, Germany.