Sytokiniinioksidaasigeenin yliekspression vaikutus lituruohon juuren jälsisolukon sekundääriseen kasvuun ja Dof-geeniperheen ekspression karakterisointi

Abstract

Opinnäytetyön tarkoituksena oli karakterisoida Dof-mutanttilinjojen geeniekspressiota, sekä selvittää estradiolilla indusoitavan sytokiniinioksidaasigeenin yliekspression vaikutusta kasvin fenotyyppiin ja löytää saatujen tietojen avulla lupaavat linjat jatkotutkimuksia varten. Sytokiniinioksidaasigeenin yliekspressiolinjojen CKX30 ja CKX32 analysoiminen perustuu T-DNA-insertion avulla tehtävään mutaatioon, jossa estradioli-indusointi saa aikaan sytokiniinia hajottavan proteiinin liikatuotannon. Sytokiniini on tärkeä osatekijä juurten sekundäärisessä kasvussa. Mutaation vaikutuksia lituruohon fenotyyppiin arvioitiin tarkkailemalla RFP-ekspression voimakkuutta ja sijaintia juuressa, sekä vertailemalla estradioli-indusoitujen mutanttilinjojen juurten sekundääristä kasvua DMSO-kontrollimaljalla kasvaneiden saman mutanttilinjan edustajien, sekä villityypin (Columbia) linjojen kehitykseen. Dof1-, Dof2- ja Dof3-mutanttilinjat tuotettiin laboratoriossa kasvattamalla transgeeniset bakteerikannat, jotka transformoitiin villityypin kasveihin. T-DNA-insertiovektorin transformaatiossa käytettiin floral dip–menetelmää. Geenin ekspressioalueita pyrittiin karakterisoimaan RFP- ja GUS-merkkigeenien avulla. Keskeisinä tuloksina homotsygooteista CKX-linjoista löytyi 4 tilastollisesti merkitsevää linjaa, joissa esiintyy mahdollinen sekundääriseen kasvuun vaikuttava fenotyyppi. Suurin ero villityypin ja ohuimman mutanttilinjan (CKX32 9-5) välillä oli –269 μm, ja estradioli- ja DMSO-maljoilla kasvatettujen saman mutanttilinjan edustajien välillä oli -220 μm. Saatujen tietojen avulla voidaan karsia useita tutkittavia mutanttilinjoja pienestä otoksesta huolimatta. Dof1- ja Dof2-linjojen GUS-ekspressio sijoittui parenkyymisolukkoon koko juuren pituudelta, kun Dof3-linjassa ekspressio näkyi kaikkialla solukossa, mutta vain vanhimmissa juurten osissa.

The aim of this thesis was to characterise the location of Dof gene expression in the roots of Arabidopsis thaliana mutant lines, and analyse how over-expression of estradiol induced cytokinin oxidase gene effects to root phenotype. In cytokinin oxidase over-expression lines CKX30 and CKX32 a T-DNA-insertion causes a gene mutation that leads to overproduction of cytokinin disruptive protein when exposed to estradiol. Cytokinin is an important operator in the secondary growth of the root. The conclusions were made by observing the location and intensiveness of RFP-expression and comparing the secondary growth of induced mutant lines to non-induced identical mutant lines and wild type plants. The thickness of the root were measured from cross sections taken 0.5 cm below hypocotyl. Dof1, Dof2 and Dof3 lines were produced in laboratory by growing transgenic bacterial strains containing T-DNA-insertion vector and transforming them to wild type plants using floral dip method. The location of gene expression could be visualized by using RFP and GUS marker genes. As the mainline results were found 4 statistically significant mutant lines, which possibly had phenotype modifications having an impact to secondary growth of the root. The big-gest difference between the most tenuous estradiol induced plants compared to DMSO and wild type controls were shown in line CKX32 9-5. In this line the width of the estradiol induced roots were –269 μm in comparison to DMSO controls and -220 μm in comparison to wild type. The purpose of this study was to help narrow down the amount of cambium mutant gene plant lines, and help for further research. GUS expression in Dof1 and Dof2 lines were located in parenchyma cells. In Dof3 line, GUS expression appeared only in the developmentally older parts of the root, but didn’t seem to be specific to any cell type.