Erilaistumattoman metsäkuusen solukon kryopreservaatio ja fenolianalyysi

Abstract

Ligniini on yleisin fenolipolymeeri maapallolla selluloosan jälkeen. Nykypäivänä ligniinillä on monta potentiaalista sovelluskäyttöä ja se on mielenkiintoon kohde monissa tutkimuksissa. Tutkimusta on helpompi toteuttaa, kun kyseessä on vain osa kasvia, eikä kokonainen puu, jonka kasvu kestää monia vuosia. Kun tutkimusryhmä on löytänyt solukkoa, jolla on kaikki halutut ominaisuudet (tässä tapauksessa ligniinin tuotanto kasvatusalustaan), sitä olisi hyvä oppia säilyttämään tulevia tutkimuksia varten muuttumattomana – kryopreservaation eli kylmäsäilytyksen kautta. Työn tavoitteena oli selvittää, vaikuttavatko valon määrä ja kasvihor-monin (auksiinin) määrä metsäkuusen solujen selviytymiseen kryopreservaatiosta. Solukot jaettiin ryhmiin: toinen ryhmä oli kasvatettu jatkuvassa valossa ja toinen ryhmä ryt-mivalossa (16 h valoa / 8 h pimeää). Jokainen pääryhmistä jaettiin alaryhmiin: toinen osa kasvoi normaalilla määrällä auksiinilla (0,01 mM) ja toinen puolella normaalista määrästä (0,005 mM). Työn aikana huomattiin, että tietyt solukot (kryopreservaation jälkeen ruskeaksi muuttuvat solukot) selviytyvät paremmin kuin vaaleaksi muuttuva solukko. Oletettiin, että värimuutos johtuu fenolien hapetuksesta kryopreservaation aikana, ja mitä enemmän fenoleja sitä parempi mahdollisuus selviytyä. Tätä päätettiin tutkia tarkemmin fenolianalyysin avulla. Kirjal-lisuudessa on kuvattu useita fenolianalyyseja erilaisille kasvityypeille, huomattavan suuri osa työstä oli menetelmän optimointia metsäkuusisolukoille. Saadut tulokset analysoitiin SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) -ohjelmistolla. Fenolianalyysin tulokset jaetiin kasvatusolosuhteiden perusteella valoryhmään, auksii-niryhmään ja solutyyppiryhmään. Tulosten tarkastelussa hyödynnettiin Shapiro- Wilk -testiä ja Mann-Whitney U -testiä. Tulokset analysoitiin ja niitä verrattiin ryhmien sisällä. Mann-Whitney U -testin perusteella valolla ja auksiinilla ei ollut vaikutusta selviytymiseen kryopreservaatiosta. Sen sijaan solukkotyypillä oli merkitystä selviytymiseen kryopreservaatiosta. Sama pätee fenolipitoisuuksiin: solukkotyyppien fenolipitoisuuksilla oli merkitsevä ero.

Lignin is one of the most abundant phenolic polymers on Earth after the cellulose. Nowadays, lignin has many potential applications, and it is a research interest for many researches. The scientific research is easier to implement when only a part of a plant is in use, instead of a whole tree. When the research team has found a callus suitable for the research, with desired qualities (in this case - lignin production into culture media), it would be necessary to learn how to preserve the callus for future studies. Cryopreservation or cold storage is the most popular way of long-time storage. The goal of this thesis was to find out if the amount of light, a type of the callus and a plant hormone (auxin) have an impact on survival from cryopreservation of undifferentiated spruce callus. The spruce callus was divided into two groups: the first group had been growing in a continuous light and the second group under a regime light (16 h light / 8 h dark). Each of the main groups was divided into subgroups: the first subgroup was growing on the normal amount of auxin (0,01 mM) and the second subgroup on the half of the normal amount (0,005 mM). During the experiment, certain calluses became brown (they were named hard calluses) after the cryopreservation and survived at a better rate than the callus that turned pale (soft callus). It was assumed that the reason for the change of the color was the oxidation of phenols in callus during cryopreservation. Somehow intracellular phenols helped the callus to survive from cryopreservation. It was decided to examine the finding in more detail by means of phenol analysis. There are a number of phenol analyzing methods available. The optimization of the method for spruce cells consumed a significant amount of time. The results of phenol analysis and the results from cryopreservation were divided into groups according to the amount of light, the amount of auxin and the type of the callus. The results were analyzed using an SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) tool within these groups (hard callus vs. soft; regime light vs. continuous light and normal auxin vs. half of the amount). Shapiro- Wilk's test was used to check the normal distribution of the results. Non-parametric Mann-Whitney U test were used to determine if there were any differences in the equality of medians. Mann-Whitney U-test showed that the light and the auxin had no effect on survival from cryopreservation. Instead, the type of callus had an impact on surviving rate. The same was true for the phenol analysis: the distribution of phenols was not the same across the categories of callus type.