Optimaalisen mittauslaitteen määrittäminen Quant-iT dsDNA, High sensitivity -kitille

Abstract

Opinnäytetyö suoritettiin Thermo Fisher Scientificille, ja sen tarkoituksena oli selvittää Quant-It dsDNA High Sensitivity -kitille optimaalinen laite, kun analysoidaan pieniä DNA-pitoisuuksia. Valittua laitetta on jatkossa tarkoitus suositella kyseisen kitin käyttöön. Optimaalinen laite valittiin määrittämällä eri laitteille DNA:n toteamis- ja määritysrajat käyttämällä kitin reagensseja. Testatut laitteet olivat Varioskan LUX, Fluoroskan ja Qubit™ 3.0 Fluorometri.

Mittauksissa käytetty kitti perustuu DNA-molekyyliin sitoutumiseen fluoresoivaan fluorokromiin. Kaikki laitteet mittaavat fluoresenssisignaalia, joita verrattiin kitin mukana tulleiden kalibrointiliuosten tunnettuihin DNA-konsentraatioihin. Kalibrointisuorat olivat kaikki melko lineaarisia, mutta jokaisella laitteella suurimman kalibrointipisteen rinnakkaismääritysten hajonta oli melko suurta.

Toteamis- ja määritysrajat määritettiin analysoimalla ”blank”-näytteitä kitin mukana tulleiden kalibrointiliuosten avulla. ”Blank”-näytteinä käytettiin sekä kitin puskuriliuosta, että kitin ensimmäistä kalibrointiliuosta, jonka konsentraatioksi ilmoitettiin 0 ng/µl. Kaikkia liuoksia pipetoitiin mustalle ja valkoiselle, 96- ja 384-kaivoiselle mikrokuoppalevylle, jotta voitiin määrittää myös paras mikrokuoppalevy kitin käyttöä varten. Qubit-laitteella näytteet analysoitiin sitä varten tarkoitetuissa Qubit-putkissa.

Lisäksi tehtiin saantokoenäytteitä pienillä pitoisuuksilla. Niillä pyrittiin varmistamaan määritettyjä toteamis- ja määritysrajoja, etenkin koska ne olivat hyvin pieniä verrattuna kitin standardinäytteiden pitoisuuksiin.

Tulosten perusteella paras laite kitin käyttöön on Varioskan LUX, jonka kanssa käytetään mustaa 96-kaivoista mikrokuoppalevyä. Tällä yhdistelmällä saatiin paras toteamis- ja määritysraja, sekä parhaat saantoprosentit.

The study was done for Thermo Fisher Scientific. The purpose was to evaluate the optimal instrument for Quant-it dsDNA High Sensitivity assay kit when low concentrations are analyzed. The chosen instrument will be recommended for using this kit. The optimal instrument was chosen by evaluating limits of detection and quantification for different instruments. Tested instruments were Varioskan LUX, Fluoroskan and Qubit 3.0 Flurometer.

Quant-it dsDNA High Sensitivity assay kit is based on fluorochrome that is fluorescent as it bonds with DNA molecule. Therefore, every instrument measures fluorescence. Fluorescence signal was plotted against concentrations of the standard samples which were delivered with the kit. Every calibration curve was linear but the strongest standard samples had very high standard deviation.

Limits of detection and qualification were evaluated by measuring blank samples using calibration samples delivered with the kit. Buffer solution and first calibration solution were used as a blank sample. Every solution was pipetted to black and white, 96- and 384-well plates in order to evaluate the best well plate for use of the assay kit. Measurements with the Qubit fluorometer were done in special Qubit-tubes.

In addition, recovery samples were made and analyzed with low concentrations. This was because LOD and LOQ values were so low compared to the lowest calibration solution delivered with the assay kit.

According to results the best instrument for the kit is Varioskan LUX with black 96-well plate. LOD and LOQ values were the lowest and recoveries accurate and precise.