ELISA-menetelmän pystytys ja naudan sytokiinien osoittaminen maito- ja seeruminäytteistä KNS-mastiitissa

Abstract

Tässä opinnäytetyössä pystytettiin ELISA-menetelmä naudan sytokiininen mittaamiseksi koagulaasinegatiivisilla stafylokokeilla infektoitujen nautojen maito- ja seeruminäytteistä. Opinnäytetyö tehtiin osana professori Antti Iivanaisen ja professori Satu Pyörälän Kokeellinen KNS-mastiitti –yhteistyöprojektia.

Sytokiinit ovat osa elimistön puolustusjärjestelmää. Ne ovat pieniä solujen erittämiä proteiineja, jotka toimivat osana tulehdusreaktiota. Sytokiinien erittymistä koagulaasinegatiivisten stafylokokkien aiheuttamassa mastiitissa ei ole aiemmin tutkittu. Infektiota tutkimalla saadaan tärkeää tietoa infektioita aiheuttavista lajeista sekä infektioiden kestosta. Samalla saadaan tietoa naudan immuunijärjestelmän toiminnasta, mitä puolestaan voidaan käyttää hyväksi kehitettäessä uusia keinoja diagnosoida mastiittia.

Työ aloitettiin pystyttämällä menetelmä sytokiinien mittaamiseksi. Menetelmän pystytyk-sessä etsittiin sopivimmat vasta-ainepitoisuudet ja rekombinanttiproteiinien laimennossarjojen pitoisuudet. Näytteiden analysointiin valitut ”capturing”-vasta-aineen pitoisuudet olivat IL-1β 4 µg/ml, IL-8 4 µg/ml, TNF-α 1 µg/ml. Käytetyt detektiovasta-ainepitoisuudet oli-vat IL-1β 2 µg/ml, IL-8 20 ng/ml, TNF-α 2,5 µg/ml. Lisäksi menetelmää pystytettäessä tarkistettiin vasta-aineiden kyky tunnistaa naudan sytokiinejä. Etukäteen suunnitelluista mittauksista IL-6 jouduttiin jättämään myöhempään ajankohtaan, sillä käytetyt IL-6-vasta-aineet eivät tunnistaneet naudan sytokiinejä.

Menetelmällä pystyttiin mittaamaan tarkoitetut maito- ja seeruminäytteet. Näytteet olivat peräisin naudoista, jotka oli tartutettu joko Staphylococcus epidermidis tai Staphylococcus simulans -kannoilla. Tämän opinnäytetyön tuloksissa esitetään kaikkien nautojen tulokset kahden tartutuksen ajalta. Maitonäytteistä mitattiin IL-1β-pitoisuuksia 0 - 3,5 ng/ml, IL-8-pitoisuuksia 0 - 0,11 ng/ml ja TNF-α-pitoisuuksia 0 - 51 ng/ml välillä. Seeruminäytteiden pitoisuudet vaihtelivat IL-1β 0 - 0,065 ng/ml, IL-8 0 - 0,016 ja TNF-α 0 - 62 ng/ml. Mitatut tulokset olivat oletettua tasoa. Tässä opinnäytetyössä käsiteltyjen tulosten joukko on liian pieni, jotta siitä voitaisiin tehdä laajempia päätelmiä tai tilastollista vertailua.

The aim of this study was to optimize ELISA protocol for measuring cytokines from CNS infected bovine milk and serum samples. The study was carried out as part of Professor Antti Iivanainen’s and Professor Satu Pyörälä’s co-operation project “Experimental CNS Mastitis”.

Cytokines are one part of the immune system. They are small proteins secreted by several different cell types. Cytokines act as part of inflammation reaction. The secretion of cytokines in mastitis caused by a CNS infection has not been studied before. Studying the infection can provide important information of the bacterial species that have caused the infection and about the duration of the infection. At the same time new information about bovine immune system can be collected. That information can be used to develop new ways to detect mastitis.

The study was started by optimizing the ELISA protocol. The first step at optimizing was to find the most suitable concentrations for antibodies and recombinant protein dilutions for standard curves. Antibody concentrations which were chosen to be used for measuring samples were IL-1β 4 µg/ml, IL-8 4 µg/ml, TNF-α 1 µg/ml for capturing antibody and IL-1β 2 µg/ml, IL-8 20 ng/ml, TNF-α 2,5 µg/ml for detecting antibody. The ability of antibodies to detect bovine cytokines was tested as a part of optimizing the protocol. The IL-6 analysis was postponed to a later date as it was found that IL-6 antibodies were not able to recognise bovine cytokines.

The protocol turned out to be successful in the measurement of these samples. The samples were collected from cows, which were infected with either Staphylococcus epidermidis or Staphylococcus simulans. This study presents all of the samples from two different times of infection. Cytokine levels in milk samples were IL-1β 0-3,5 ng/ml, IL-8 0-0,11 ng/ml and TNF-α 0-51 ng/ml and in serum samples IL-1β 0-0,065 ng/ml, IL-8 0-0,016 and TNF-α 0-62 ng/ml. The results obtained in this study correspond with the results of previous studies. The results of this study are, however, too few to allow for any further conclu-sions or statistical analysis.