LACTOBACILLUS SOBRIUS -KANNAN PINTAKERROSPROTEIINIGEENIN KLOONAUS, ILMENTÄMINEN JA PROTEIININ KIINNITTYMISOMINAISUUDET

Abstract

Tämä opinnäytetyö tehtiin Helsingin yliopiston eläinlääketieteellisen tiedekunnan perus-eläinlääketieteen laitoksella.

Lactobacillus sobrius -lajilla on todettu olevan probioottisia vaikutuksia porsailla, ja sillä on havaittu adheesiota suolen limakalvoille ja epiteelisoluihin toistaiseksi tuntemattomalla mekanismilla. Tutkimuksen kohteena on pintakerrosproteiinin mahdollisesti aiheuttama adheesio ja pintakerrosproteiinin mahdolliset sovellukset antigeenien kuljettajana.

Tämän työn tarkoituksena oli kloonata L. sobrius GRL1110 -kannan pintakerrosproteiinia (Slp, Surface Layer Protein) koodaava geeni, tuottaa pintakerrosproteiinia Esherichia coli -bakteerissa ja tehdä alustavia adheesiokokeita sian suolen epiteelisolujen (IPEC-1) kans-sa.

L. sobrius -solujen pinnalta uutettiin proteiinit, joista oikean kokoinen valittiin N-terminaaliseen aminohapposekvensointiin. Sekvenssin perusteella tehtiin alukkeet, joilla saatiin PCR:llä monistettua slp1-geeni. Geeni ligatoitiin pET-28b(+)-vektoriin ja elektro-kompetentit E. coli -solut transformoitiin. Rekombinanttiproteiinia tuotettiin E. coli -ekspressiosoluissa, ja saatu proteiini puhdistettiin affiniteettikromatografialla. L. sobrius -kannasta eristettiin soluseinät. Pintakerrosproteiinin sitoutumista testattiin soluseiniin, ja kokonaisten L. sobrius -solujen ja soluseinien sitoutumista testattiin sian suolen epitee-lisolulinjaan (IPEC-1).

L. sobrius -soluja sitoutui IPEC-1 -soluihin suunnilleen yhtä paljon riippumatta siitä, oliko niistä uutettu pintakerrosproteiinit guanidiinihydrokloridilla vai ei. Tämä viittaisi siihen, että jos pintakerrosproteiini aiheuttaakin adheesiota epiteelisoluihin, niin myös jokin toinen komponentti L. sobrius -soluissa aiheuttaa sitä. Eristetyt soluseinät eivät kuitenkaan sitou-tuneet epiteelisoluihin sellaisenaan, ja jatkossa lähdetään tutkimaan, sitoutuvatko pinta-proteiinikerroksella peitetyt soluseinäfragmentit IPEC-1-soluihin.

This study was carried out at the University of Helsinki, in the Faculty of Veterinary Medi-cine, Department of Basic Veterinary Sciences.

Lactobacillus sobrius is known to have probiotic effects in piglets and studies have shown that it adheres to porcine intestinal mucus and epithelial cells through an as yet unknown mechanism. The purpose of this study is to examine whether the surface layer proteins are the cause of this adhesion and if the proteins could be used as antigen delivery vehicles.

The main aims of this study are to clone the surface layer protein gene of L. sobrius GRL1110, to express the slp-gene in Esherichia coli and to carry out some preliminary adhesion experiments with a piglet intestinal cell line IPEC-1.

Proteins were extracted from the surface of L. sobrius cells, and the protein of the right size was sent to N-terminal amino acid sequencing. Based on the sequence, primers were made and the slp1 gene was amplified by PCR. The gene was ligated to pET-28b(+)vector and the electro competent E. coli cells were transformed. Recombinant pro-teins were expressed in E. coli and the proteins were purified by affinity chromatography. The cell walls were isolated from L. sobrius. The adhesion of the surface layer proteins to the cell walls as well as the adhesion of entire L. sobrius cells and cell walls to porcine intestinal epithelial cells (IPEC-1) was tested.

The tests showed that L. sobrius cells adhered to IPEC-1 cells at about the same degree regardless of whether they had been extracted by guanidine hydrochloride or not. This implicates that even if the surface layer protein has a central role in creating adhesion to epithelial cells, some other component in L. sobrius participates in the process as well. However, plain cell walls did not adhere to epithelial cells, and thus further study is needed in order to determine whether cell walls coated with surface layer proteins adhere to IPEC-1 cells.