Useiden eri lääkeaineiden kvantitatiivinen määrittäminen verestä GC/EI-MS:lla - menetelmän kehittäminen ja validointi

Abstract

Opinnäytetyö tehtiin Kansanterveyslaitoksen Huumetutkimusyksikössä. Työn tavoitteena oli kehitellä useiden eri lääkeaineiden kvantitatiivista määritystä varten luotua menetelmää lisäämällä siihen uusia analysoitavia yhdisteitä ja sisäisiä standardeja. Lopuksi menetelmä validoitiin uudelleen.

Menetelmän kehittämisvaiheessa päätettiin, mitä yhdisteitä alkuperäisestä menetelmästä poistetaan ja mitä lisätään. Uusien yhdisteiden testiajojen jälkeen yhdisteiden lopulliseksi määräksi muodostui 28 analysoitavaa yhdistettä ja kuusi sisäistä standardia. Validointivaiheessa tutkittiin lineaarisuutta, selektiivisyyttä, toistettavuutta, määritysrajaa, derivatisoinnin stabiilisuutta, uuton saantoa ja mittausepävarmuutta.

Menetelmällä analysoitavat lääkeaineet on jaoteltu kuuteen ryhmään: trisykliset antidepressantit ja muut masennuslääkkeet, selektiiviset serotoniinin takaisinoton estäjät, opioidit, fentiatsiinin johdokset ja muut antipsykootit, lihasrelaksantit sekä unilääkkeet ja hallusinogeenit.

Näytteiden esikäsittelyssä analysoitavat yhdisteet uutetaan näytematriisista orgaaniseen liuottimeen emäksisissä olosuhteissa. Uuton jälkeen uuttoliuotin haihdutetaan, yhdisteet liuotetaan haihdutusjäännöksestä asetonirtiiliin ja lopuksi derivatisoidaan. Analysointi suoritetaan kaasukromatografi-massaspektrometrilla kohdeioniseurantaa käyttäen.

Validointitulosten perusteella menetelmällä voidaan määrittää kvantitatiivisesti 24 eri yhdistettä kuuden sisäisen standardin avulla. Lisäksi menetelmästä löytyy neljä semikvantitatiivista yhdistettä, jotka eivät täyttäneet validoinnissa kaikkia kvantitatiivisen määrityksen kriteereitä.

This thesis was performed in the National Public Health Institute`s Drug research unit. The main aim was to develop further a method of quantification that has been created for simultaneous analysis of several drugs in blood. Another important objective was to re-validate the method.

The first step in developing the method was to decide which compounds were not acceptable in the old validation and which compounds could probably be added to the method. After testing the new drugs, the final number of compounds to be analyzed amounted to 28 with six different internal standards. The validation procedure focused on studying linearity, selectivity, precision, the lowest limit of quantification, stability of derivatization, yield of extraction and uncertainty of measurement.

The drugs to be analyzed were categorised into six groups: tricyclic antidepressants and other medicines for depression, selective serotonin reuptake inhibitors, opioids, fentiazin derivatives and other antipsychotics, muscle relaxants and sleep medicines along with hallucinogens.

In pre-treatment of the samples the compounds were extracted from blood into an organic solvent in alkaline surroundings. After the extraction the solvent was evaporated and the compounds were dissolved from residue in acetonitrile and finally derivated. The analysis was performed by gas chromatography-mass spectrometry with selected ion monitoring.

The results of this study show that 24 different compounds with six internal standards can be analyzed using this method. In addition it was found that four semiquantitative compounds did not pass all the criteria for quantitative measurements.