Yksilöntunnistus suoraan verestä tehtävällä polymeraasiketjureaktiolla genotyyppimäärityksen laadunvarmennukseen

Abstract

Yksilöntunnistusta käytetään esimerkiksi rikostutkinnassa ja isyystesteissä sekä elinsiir-toelinten luovuttajia etsiessä. Tässä työssä oli tarkoitus optimoida rutiinitoimeksi tulevaa yksilöntunnistusmenetelmää yksilön ja tästä genotyyppimääritykseen saapuvan näytteen yhteneväisyyden varmentamiseen. Kehitettävän yksilöntunnistusmenetelmän on tarkoituk-sena toimia genotyyppitulosten laaduntarkkailun välineenä, kun muita luotettavia varmen-nuskeinoja ei ole. Näytteenkäsittelyssä on aina riski näytteen tai näytekirjausten sekaantu-miseen, jolloin yksilön genotyyppi ei vastaa todellisuudessa yksilöä. Tämä saattaa johtaa vääriin tulkintoihin henkilön terveydestä tai häiritä tuloksiin perustuvien tutkimusten onnis-tumista.

Polymeeraasiketjureaktio (PCR) tehdään yleensä eristetylle DNA:lle. Reaktio vaatii tarkkaa optimointia muun muassa monistettavan DNA-jakson pituuden, alukkeiden määrän sekä kiinnittymiskohdan suhteen. Myös mahdolliset epäpuhtaudet häiritsevät tai voivat estää reaktiota tapahtumasta. Suoraan verestä tehtävän PCR:n haasteita ovat arvaamattomat reaktio-olosuhteet veren sisältämien soluaineksen, valkuaisaineiden ja muiden epäpuhtauk-sien takia. Suoraan verinäytteestä puskuriin liuotetun näytteen DNA-konsentraatiota ei myöskään tunneta.

Tämän insinöörityön tarkoituksena oli kehittää Suomen molekyylilääketieteen instituutin (FIMM) teknologiakeskukselle genotyypityslaboratorioon yksilöntunnistusmenetelmää suo-raan verestä tehtävän PCR:n avulla. Menetelmän kehitys on aloitettu aikaisemmin tutkija Päivi Lahermon johdolla. Tässä työssä oli tarkoituksena optimoida PCR-reaktioon tarvitta-van näytteen määrää ja käsittelytapoja sekä käytettyjen markkerien toimivuutta. Lisäksi arvioidaan tilastollisesti yksilöntunnistamiseen vaadittavien SNP (Single Nucleotide Poly-morphism)-markkerien lukumäärää.

Tässä työssä käytettiin 27 SNP-markkeria yhteensä 46 näytteelle kolmessa eri ajossa. Näytetilavuutta saatiin optimoinnilla parempaan suuntaan ja näytesäilytykseen kehitettiin uusi tapa. Yksilöntunnistusmenetelmää saatiin kehitettyä toivottuun suuntaan ja menetel-mää voidaan jatkossa käyttää yksilöntunnistamiseen insinöörityössä testatuilla markkerien lukumäärillä.

Individual identification is used, for instance, in criminal investigation, in paternity tests and in the search for an organ transplant donor. In this thesis, the purpose was to optimize a method for verifying the identity of project samples by direct whole blood polymerase chain reaction. The developed method is supposed to become a quality-control tool for a geno-typing laboratory when there are no other suitable verification methods available. It is al-ways a possible that samples get mixed up during sample handling or genotyping and that an individual’s records and genotypes, therefore, do not match. This leads to incorrect re-sults and to false interpretations of an individual´s health or can interfere with the success of the research based on the results.

Polymerase chain reaction (PCR) is usually made to an isolated DNA sample. The reaction requires careful optimization of, for example, the length of an amplified DNA fragment and concentrations or sequences of the primers. The possible contaminations in the sample can also prevent the reaction from occurring. Additional challenges of direct whole-blood PRC are unpredictable reaction circumstances due to cell material, proteins and other contami-nants contained in the blood sample. DNA concentration of unprocessed blood samples dissolved in buffer are also not known.

The aim of this thesis was to develop an individual identification method that uses whole blood PCR for the Genotyping Unit in Technology Centre of the Institute for Molecular Medicine Finland (FIMM). The development of this method was originally started under the leadership of Senior Researcher Päivi Lahermo. This thesis aimed to optimize the sample volume needed for PCR, the treatment methods of the samples and to test the reliable functioning of the used markers. In addition, the number of SNP (Single Nucleotide Poly-morphism) markers required for identifying an individual were statistically estimated.

In this work 27 SNP markers were used to genotype 46 individuals in 3 different runs. The sample volume was optimized, and a new method for storing the samples was devised. The identification method was developed into the desired direction by this thesis, and the method can be used for identification of the genotyped individuals with the tested numbers of markers.