EGFR-geenin Thr790Met-mutaatiotestin pystyttäminen Droplet Digital PCR -menetelmällä

Abstract

Opinnäytetyön tarkoitus oli pystyttää Droplet Digital PCR (ddPCR) -menetelmällä toimiva testi EGFR-geenin Thr790Met-mutaation ilmenemisen seurantaan. Seurantaa on tarkoitus tehdä ei-pienisoluista keuhkosyöpää sairastaville potilaille, joita on hoidettu tyrosiinikinaasin estäjillä (TKI), jotta voidaan ennakoida hoidon myötä kehittyvää TKI-resistenssiä. Lisäksi testille laadittiin työohje.

Testi otettiin käyttöön analysoimalla 59 parafiinileikkeistä eristettyä DNA-näytettä. Osa näytteistä oli tunnettuja Thr790Met-positiivisia näytteitä ja osa negatiivisia, suurin osa näytteistä oli eristetty keuhkokudoksesta ja jotkin vertailunäytteet myös muista kudoksista kuin keuhkoista. Referenssimenetelminä käytettiin uuden sukupolven sekvensointia (NGS) ja reaaliaikaista kvantitatiivista PCR:ää (qPCR).Tulokset analysoitiin QuantaSoft Analysis Pro -ohjelmistolla ja Microsoft Office Excel -taulukkolaskentaohjelmalla.

Droplet Digital PCR -testillä saadut tulokset olivat toistettavia ja selkeitä ja menetelmä osoittautui kohtuullisen sensitiiviseksi ja spesifiseksi. Testi myös toimi puhtaasti, sillä lähes kaikki käytetyt vesikontrollit säilyivät puhtaina prosessin ajan. Saadut ddPCR-tulokset eivät kuitenkaan olleet aivan niin yhteneviä referenssitulosten kanssa kuin olisi voinut toivoa.

Tuloksista voidaan päätellä, että Droplet Digital PCR on toimiva menetelmä EGFR-geenin Thr790Met-mutaation seurantaan.

The purpose of this study was to set up a Droplet Digital PCR -test for monitoring EGFR-gene’s Thr790Met-mutation from non-small cell lung cancer patients treated with tyrosine kinase inhibitors (TKI) to predict developing TKI-resistance. As this was my final project I also wrote a working instruction for this test.

The implementation of the test was made by examining 59 DNA-samples extracted from paraffin-embedded tissue samples, some of which were known to be positive with Thr790Met-mutation and some negative. Most samples were extracted from lung tissue but some reference samples were also extracted from other tissues than lung. I used Next Generation Sequencing (NGS) and real-time quantitative PCR (qPCR) as reference methods by comparing the results discovered with them and Droplet Digital PCR (ddPCR). I analysed the results with QuantaSoft Analysis Pro -software and Microsoft Office Excel.

The results of this Droplet Digital PCR -test were repeatable and clear and method seemed to be quite sensitive and specific. The test also performed purely, as almost all water controls stayed clean during the process. Compared to results gained with reference methods, ddPCR-results were not always as similar as I would have hoped them to be.

The results lead to the conclusion that Droplet Digital PCR is a suitable method for monitoring EGFR-gene’s Thr790Met-mutation.