Asetyylikoliinisolujen, glutamaattisolujen ja DREADD-reseptorien samanaikainen tunnistaminen immunohistokemiallisesti

Abstract

DREADD-reseptorit ovat uusia synteettisiä reseptoreita, joita voidaan aktivoida synteettisillä ligandeilla. Niitä voidaan käyttää käyttäytymiskokeissa, joissa halutaan selvittää tiettyjen yksittäisten hermosoluryhmien vaikutusta käytökseen. Käyttäytymiskokeiden tuloksia ei voida kuitenkaan tulkita, ellei varmistuta siitä, missä soluissa DREADD-reseptorit ovat ilmentyneet. Tämän takia on kriittistä kehittää menetelmiä, joilla voidaan varmistaa DREADD-reseptorien sijainti tietynlaisissa hermosoluissa.

Insinöörityössä tavoite oli kehittää vasta-ainevärjäykseen perustuva menetelmä glutamatergisten solujen, kolinergisten solujen ja DREADD-reseptorien samanaikaiseksi tunnistamiseksi hiirten aivoista. Tämä oli tärkeää, jotta käyttäytymiskokeiden tuloksia voitiin tulkita.

DREADD-vektoreita oli injektoitu 25 hiiren aivoihin, tarkoituksena saada aikaan DREADD-reseptorien ilmentämistä pedunkulopontisen tumakkeen glutamaattisoluissa. Insinöörityössä käyttäytymiskokeissa käytettyjä hiiriä perfusoitiin ja niiden aivot otettiin talteen. Aivot jäädytettiin ja niistä tehtiin leikkeitä kryostaatilla. Aivoleikkeille tehtiin immunohistokemiallista vasta-ainevärjäystä kolmella erilaisella vasta-aineella. Värjättyjä aivoleikkeitä kuvannettiin fluoresenssimikroskoopilla.

Insinöörityön lopputuloksena ei saatu luotua täysin toimivaa kolmoisvärjäysmenetelmää.

Insinöörityössä saatiin kuitenkin kaksi vasta-ainetta toimimaan samanaikaisesti siten, että VGLUT2- ja mCherry-vasta-aineet toimivat samanaikaisesti sekä ChAT- ja mCherry-vasta-aineet toimivat yhdessä. Toimivaa kaksoisvärjäystä voidaankin käyttää samoihin tarkoituksiin kuin alkuperäisenä tavoitteena ollutta kolmoisvärjäystä. Sen avulla voidaan arvioida DREADD-injektioiden osumista oikealle aivoalueelle ja DREADD-reseptorien päätymistä glutamaattisoluihin.

DREADD receptors are new synthetic receptors that can be activated with synthetic ligands. They can be used in behavioral tests, the purpose of which is to determine the connection between neuron groups and behavior. However, the results of behavior tests can only be used when the DREADD receptors can be located in specific neuron cell groups. For this reason, it is critical to develop methods to confirm the location of DREADD receptors inside certain neurons.

In this thesis, the goal was to create a method of identification for glutamatergic neurons, cholinergic neurons and DREADD receptors in the brain, using immunohistochemical staining.

DREADD vectors were injected in 25 mice, with the goal of DREADD receptor expression in the glutamatergic neurons of pedunculopontine nucleus. In this thesis, mice used earlier in behavioral experiments were perfused and their brains were collected. The brains were frozen and cut to sections with a cryostat. The sections were then immunohistochemically stained with three different markers. The stained sections were imaged with fluorescence microscope.

The results showed that the triple staining method was not fully functional

However, this thesis succeeded in creating a functional double staining for all the used markers. The functional double staining method can be used for the same purposes as the original goal of triple staining. With double staining, it is possible to evaluate whether the injections were in the right area of the brain and whether the DREADD receptors are within the glutamatergic neurons.