Kolmoiskuvantamismenetelmän kehitys hermosoluyhteyksien toiminnallisuuden tutkimiseen

Abstract

Ruokahalunsäätelyyn vaikuttavia tekijöitä on tutkittu laajalti etenkin hypotalamuksesta. Etuaivojen pohjaosassa sijaitsevien kolinergisten neuroneiden tuottamalla välittäjäaine asetyylikoliinilla on uskottu olevan myös rooli ruokahalunsäätelyssä, mutta tutkimuksia asetyylikoliinin roolin selvittämiseksi ei ole juuri tehty. Menetelmiä hermoyhteyksien tutkimiseksi on useita kuten esim. immunohistokemialliset värjäykset, in situ -hybridisaatio ja hermoyhteyksissä kulkeutuvat beadit.

Tämän insinöörityön tavoitteena oli kehittää kolmoiskuvantamismenetelmä, jota voidaan käyttää tutkittaessa uusia ja tunnettuja hermosoluyhteyksiä, jotka säätelevät syömiskäyttäytymistä. Menetelmän kehityksen jälkeen koe-eläimille suoritettiin syömiskoe, jossa käytettiin lähtötietona jo tunnettua hermoyhteyttä, joka alkaa etuaivojen pohjaosan aivoalueesta SIB päättyen mantelitumakkeen aivoalueeseen BLA. Hypoteesina oli selvittää, aktivoituiko tutkittava hermoyhteys koe-eläimillä niille suoritetulla syömiskokeella, jolloin voitiin tutkia kehitetyn kolmoiskuvantamismenetelmän toimivuutta sekä sitä, oliko kyseisellä hermoyhteyden kolinergisella signaloinnilla merkitystä ruokahalunsäätelyn kannalta.

Työ aloitettiin kolmoiskuvantamismenetelmän kehittämisellä, jossa uutena menetelmänä käytettiin RetroBead (RB), Red -lateksipalloja, jotka kulkeutuvat hermoyhteyksissä synapsista soomaan. Kolmoiskuvantamismenetelmän kehittämisellä oli tarkoituksena saada leikkeellä näkyviin RB:t ja kaksi immunohistokemiallista värjäystä - ChAT- ja c-Fos-DAB-värjäys. Onnistuneen menetelmän kehittämisen jälkeen aloitettiin varsinaiset syömiskokeet tehden RB-injektio, jonka jälkeen RB:n annettiin kulkeutua 48 h hermoyhteyksissä. Syömiskokeet suoritettiin RB:n kulkeutumisen jälkeen ja ne kestivät 1,5 h. Syömiskokeet suoritettiin kahdeksalle hiirelle, joista puolet kuului kontrolliryhmään ja puolet sukroosiryhmään. Hiirten aivot leikattiin 30 µm:n paksuisiksi leikkeiksi ja leikkeille suoritettiin immunohistokemialliset värjäykset. Leikkeet kuvattiin epifluoresenssimikroskoopilla ja laskettiin kuvissa näkyvät asetyylikoliinisolut, joissa näkyi RB:t tai RB:t ja c-Fos-proteiini. Tilastollisena analyysinä käytettiin t-testiä, luottamusvälillä 0,05, jonka tarkoituksena oli selvittää, oliko kontrolli- ja sukroosiryhmän hiirien keskiarvojen välillä tilastollisesti merkitsevää eroa.

Koko työssä kolmoiskuvantamismenetelmän kehittäminen onnistui erittäin hyvin ja on toimiva menetelmä uusien ja tunnettujen hermoyhteyksien tutkimisessa. Syömiskokeiden tilastollisessa analyysissa ei ollut tilastollisesti merkittävää eroa sukroosi- ja kontrolliryhmän hiirien välillä. Vaikka tilastollista merkitsevyyttä ei ollut, voidaan kuitenkin sanoa sukroosi- ja kontrolliryhmän hiirien välillä näkyvän selviä eroja aktiivisten solujen määrissä. Koe voidaan uusia samoja menetelmiä käyttäen kasvattaen koe-eläinten otoskokoa, jolloin tuloksista saadaan luotettavampia.

Factors affecting appetite regulation has been widely researched specifically in hypothalamus. Cholinergic neurons which produce the neurotransmitter acetylcholine and are located in the basal forebrain has been suggested to have a role in appetite control, but almost no research has been done to determine what the role is. There are many methods to research neural connections, i.e immunohistochemical stainings, in situ -hybridization and neuronal tracer’s beads.

The objective of this thesis was to develop a triple labeling method which can be used for researching brand new and already known neural connections which regulate eating behavior. After the method development, test animals underwent a feeding experiment in which the already known neural connection was used as initial data. The already known neural connection starts in basal forebrain’s brain region SIB and ends in amygdalas brain region BLA. The purpose was to determine whether the neural connection activated in the feeding experiment performed on the test animals, which could be used to research the functionality of the developed triple labeling method and to establish whether the specific neural connection’s cholinergic signaling plays a role in appetite control.

The project started by developing a triple labeling method in which retrobead (RB), red latex microspheres were used as a new method. RBs are carried from synapses to somas in neural connections. The purpose of developing a triple labeling method was to make the RBs and two immunohistochemical stainings – ChAT- and c-Fos-DAB –stainings visible. After successful deveploment of triple labeling method the actual feeding experiment started by injecting RBs and letting them carried in neural connections 48 h. After RBs were carried in neural connections feeding experiment started and lasted 1,5 h. Experiment were performed for eight mice which half of them belonged in control group and other half to a sucrose group. Mice brain were cut to 30 µm thick sections and the sections were performed immunohistochemical stainings. Images were taken of the sections by epifluorescence microscope after stainings, and from the images it was possible to count the acetylcholinecells which exhibited RBs or RBs and c-Fos-protein. A t-test was used with the confidence level of 0.05 as a statistical analysis method to determine whether there were statistically significant difference between the averages of the control group and those of the sucrose group.

The development of the triple staining method was very successful and was found to be a working method to study brand new and already known neural connections. There were no statistically significance between the control and sucrose group mice Despite the lack of statistical significance, it can be said that there were clear differences in the active cell counts. This study could be repeated using the same methods by increasing the sample size of the test animals, making the results more realiable.