Reaaliaikaisen RT-PCR-menetelmän käyttöönotto ja validointi enterovirus A71:n tunnistamiseksi

Abstract

Vuosina 2011 ja 2012 Kiinassa raportoitiin noin 4 miljoonaa enterorokkoon sairastunutta, joista reilu tuhat johti kuolemaan. Enterorokon tavallisimpia aiheuttajia ovat coxackievirus A16 ja enterovirus A71. Näistä kahdesta enterovirus A71-infektiot saattavat aiheuttaa vaikeitakin neurologisia sairauksia, joita ei tavallisesti aiheudu coxackievirus A16-infektioista. Terveyden ja hyvinvoinnin laitoksessa enterovirus A71:n osoitus on tehty virusviljelyn avulla ja kasvatettu virus on tyypitetty sekvensoimalla. Tämä on vienyt kuitenkin aikaa helposti jopa kuukauden verran. Viime vuosina on tehty useita julkaisuja enterovirus A71:n tunnistamisesta reaaliaikaisella RT-PCR-menetelmällä, jolla voidaan nopeuttaa tulosten saamista.

Insinöörityön tarkoituksena oli reaaliaikaisen RT-PCR-menetelmän validointi ja käyttöönotto enterovirus A71:n tunnistamiseksi Terveyden ja hyvinvoinnin laitoksessa. Validoinnissa käytettiin julkaisun A One-Step, Triplex, Real-Time RT-PCR Assay for the Simultaneous Detection of Enterovirus 71, Coxsackie A16 and Pan-Enterovirus in a Single Tube enterovirus A71:llä käytettyjä alukkeita ja koetinta. Validoinnissa määritettiin kvalitatiivisia parametreja käyttämällä kolmeakymmentä potilasnäytettä.

Menetelmä noudatti Terveyden ja hyvinvoinnin laitoksen Virusinfektiot-yksikössä käytössä olevaa enterovirusten reaaliaikaisen RT-PCR-menetelmän protokollaa. Validoitu menetelmä poikkeaa aiemmasta menetelmästä PCR-oligonuokleotidien suhteen, jotka ovat spesifisiä juuri enterovirus A71:lle. Validoinnissa enterovirus A71:n RNA-genomi käännettiin komplementaariseksi DNA:ksi ja tämän jälkeen käännettyä komplementaarista DNA:ta monistettiin polymeraasiketjureaktiossa. Työssä käytettiin spesifistä koetinta, joka oli leimattu fluoresoivalla FAM-leimalla.

Työn tulokset osoittivat, että reaaliaikainen RT-PCR-menetelmä sopii enterovirus A71:n osoittamiseen suoraan potilasnäytteestä ja vie aikaa vain muutamia tunteja. Käytetty menetelmä oli spesifinen juuri enterovirus A71:lle, ja se reagoi herkästi muutoksiin viruspitoisuuksissa. Tuloksia voidaan pitää luotettavina, sillä validoitu menetelmä tunnisti riittävällä tarkkuudella positiiviset ja negatiiviset näytteet odotusten mukaisiksi. Validoitu menetelmä hyväksyttiin työn tulosten perusteella potilasnäytteiden tutkimiseen Terveyden ja hyvinvoinnin laitoksessa.

In 2011 and 2012 about 4 million hand, foot and mouth disease infections were reported in China. Over a thousand of those cases led to the death. Coxackievirus A16 and enterovirus A71 are the most common causes of HFMD, but usually enterovirus A71 is the one which can cause difficult neurological diseases. In National Institute for Health and Welfare detection of enterovirus A71 is usually made by growing the viruses and after that typing those by sequencing. It can take time, easily up to one month. Recent publications have shown results of using real-time RT-PCR method to identify enterovirus A71 faster.

The purpose of thesis was to validate and introduce a real-time RT-PCR method to identify EV-A71. In validation the same primers and probe for enterovirus A71 were used as in the publication ’’A One-Step, Triplex, Real-Time RT-PCR Assay for the Simultaneous Detection of Enterovirus 71, Coxsackie A16 and Pan-Enterovirus in a Single Tube’’. In validation thirty patient samples were used to determine qualitative parameters.

The method followed the protocol of the real-time RT-PCR method for enteroviruses which is in use in THL Virus infections unit. In the validated method, enterovirus A71 specific PCR-oligonucleotides were used, which differs from the previous method. Enterovirus A71 RNA-genome was translated to complementary DNA, and after translating, it was amplified in the polymerase chain reaction. In this validation, a specific probe which was labeled with a fluorescent FAM-label was used.

The results of the validation show that real-time RT-PCR method is suitable for identifying enterovirus A71 directly from the patient’s sample and, it takes only few hours to get the results. The method used was specific for enterovirus A71 and responds sensitively to changes in viral concentrations. The results can be considered reliable because the validated method identified positive and negative samples with sufficient precision. The validated method was approved and is used for examining patient samples in THL.